陕南白山羊感染泰勒虫的种类鉴定及其遗传进化分析

于正青，宋军科，张会军，刘婷丽，范现成，赵光辉

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

泰勒虫属于泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)的蜱传性血液原虫，寄生于牛羊和其他野生动物巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内，可引起动物高热、消瘦、贫血及体表淋巴结肿大，降低动物的饲料报酬，在很大程度上阻碍了养羊业的发展[1]。自1914年首次在埃及报道泰勒虫以来，已发现可感染羊的泰勒虫有11个种，分别是吕氏泰勒虫(T.luwenshuni)、莱氏泰勒虫(T.lestoquardi)、绵羊泰勒虫(T.ovis)、尤氏泰勒虫(T.uilenbergi)、分离泰勒虫(T.separata)、隐藏泰勒虫(T.recondita)、马泰勒虫(T.equi)、 环形泰勒虫(T.annulata)、Theileirasp. B15a、Theileriasp. OT3及Theileriasp. MK[2-6]，其中T.uilenbergi、T.luwenshuni及T.lestoquardi致病力最强[6-7]，而T.ovis、T.recondita、T.separata、Theileriasp. OT3及Theileriasp. MK致病性很弱或无致病性[1,7-11]。在中国已报道的羊泰勒虫有T.luwenshuni、T.ovis及T.uilenbergi[12]，以T.luwenshuni和T.ilenbergi的混合感染较为常见[7]。对羊泰勒虫病传统的诊断方法是显微镜镜检，结合流行病学特点并寻找宿主蜱来确诊，但该方法准确性差、检出率低，且需要非常专业的人员[12]。随着分子生物学的发展，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，real-time qPCR)及反向线状印迹(reverse line blot，RLB)等方法有着灵敏、高效及操作简单等优点而应用于羊泰勒虫的检测[3,13-15]。

近年来，随着养羊业的迅速发展，羊泰勒虫病的发病趋势也在逐步上升，而该病在自然感染病例中常为隐性感染，加剧了该病的防控难度[13]。陕西省作为我国重要的养羊大省，拥有众多的地方品种。其中分布于汉中、安康等陕南地区的陕南白山羊因皮质好，同时具有良好的产肉性能，是典型的肉皮两用品种。由于陕南地区多处于秦岭山脉，林草资源丰富，但也成为蜱生长繁殖的理想场所，因此，该地区动物也受到蜱传病的危害。为了解陕南白山羊泰勒虫的感染现状和特点，本研究基于核糖体小亚基RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因位点的分子生物学技术,对该地区陕南白山羊泰勒虫的感染情况进行调查，并对泰勒虫SSU rRNA基因进行测序分析，研究结果将为该地区羊泰勒虫病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 来自陕西省镇巴县3个羊场的山羊血液，其中3月龄～6月龄14份，7月龄～12月龄35份，大于12月龄72份。

1.1.2 主要试剂 姬姆萨染色液，北京索宝生物科技有限公司产品；血液基因组DNA提取试剂盒SK8254，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；ExTaqDNA聚合酶、6 × Loading buffer、DNA Marker DL 5 000、溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)，宝生物工程(上海)有限公司产品；琼脂糖，上海英潍捷基贸易有限公司产品。

1.1.3 仪器设备 SW-CJ型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；C-XP-D型PCR扩增仪，杭州博日科技有限公司产品；HC3018型台式高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；DYY-12型电泳仪，北京市六一仪器厂产品；ChampGel 5000型紫外凝胶成像系统，北京赛智创业科技有限公司产品；AUY220型精密电子天平，上海光学仪器一厂产品；高压蒸汽灭菌锅，上海人和科学仪器有限公司产品；微量移液器，北京大龙兴创公司产品。

1.2 方法

1.2.1 血液样品采集 2017年7月从陕西省镇巴县3个羊场(分别以XX、SX和SH命名)共采集到山羊血液样品121份。使用一次性灭菌器材经颈静脉采血，采集的血液样品立即置于含有2 mL 15 mg/mL K3-EDTA的抗凝管中并保存在冰盒中，运回实验室于4 ℃冰箱保存待检。

1.2.2 血液涂片制作 取约3 μL血液样品,均匀涂于载玻片上待自然风干后，放入无水甲醇中固定2 h，取出后在室温下自然晾干；将晾干的载玻片用姬姆萨染液染色30 min后取出自然风干，然后再用蒸馏水冲洗以去除染色颗粒，待染色血液涂片自然风干后置于100倍油镜下观察。

1.2.3 基因组DNA的提取 从血液样品中取出100 μL血样移入1.5 mL离心管中，按照血液基因组DNA提取试剂盒SK8254说明书进行操作,提取血液基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。

1.2.4 套式PCR扩增 根据Ge Y等[15]已发表的扩增泰勒虫SSU rRNA基因的引物(表1)进行套式PCR扩增。本研究中所用引物均由擎科泽西生物科技有限责任公司(西安)合成。PCR扩增体系为：ExTaq酶0.2 U，2.5 μL 10 × PCR buffer，1.5 μL MgCl2(25 mmol/L)，2.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，加双蒸水至25 μL。PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃ 30 s， 30 s(退火温度见表1)，72℃ 30 s，共30个循环；72℃ 10 min。取4 μL PCR扩增产物在含0.5 μg/mL溴化乙锭的10 g/L琼脂糖凝胶电泳结束后，于凝胶成像系统下观察结果。

表1 引物序列

1.2.5 序列分析及遗传进化树构建 电泳结果PCR阳性产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，使用的测序仪为ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer(Applied Biosystems，USA)。测序成功的序列用Clustal X 1.83进行比对并参考图谱校正序列，将校正后的序列运用BLAST进行同源性搜索，与GenBank中已有的相应序列进行同源性比对分析。获取自GenBank中的T.luwenshuni(JN676988、AF081136)、T.ovis(FJ603460、EU622911)、T.separata(AY260175)、Theileriasp. OT3(DQ866839、AY533145)和T.uilenbergi(KJ188232、JF719835)SSU rRNA基因序列，以Babesiaovis(AY150058)SSU rRNA基因序列作为外群，利用MEGA 7.0软件，用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)和Kimura 2-parameter模型构建SSU rRNA基因遗传进化树，Bootstrap值为1 000。

1.2.6 统计分析 利用SPSS 19.0软件对陕南白山羊不同年龄段感染率进行χ2检验，当P<0.05时，差异显著；当P>0.05时，差异不显著。

2 结果

2.1 山羊血液涂片染色镜检观察

通过对制备的血液涂片进行显微镜观察，发现112份血液样品中的红细胞内存在大小约1 μm，呈圆点形、卵圆形或短杆状多形性虫体(图1)。

2.2 PCR扩增结果

对121份DNA样品的SSU rRNA基因进行套式PCR扩增，其中112份样品(92.6%)成功扩增，凝胶电泳显示，阳性样品在1 400 bp处出现目的条带(图2)。

2.3 山羊泰勒虫感染情况

本研究中的镜检结果与套式PCR结果完全一致。所检测的121份羊血液样品中，泰勒虫总感染率为92.6%(112/121)。其中3月龄～6月龄感染率为92.9%(13/14)，7月龄～12月龄感染率为94.3%(33/35)，大于12月龄感染率为91.7%(66/72)。不同年龄段之间差异不显著(月龄P>0.05)。3个羊场中，SH羊场感染率为95.0%(38/40)，XX羊场次之，为92.9%(39/42)，SX羊场感染率为89.7%(35/39)。

A.阳性样品；B.阴性样品；a.圆点形虫体；b.卵圆形虫体；c.短杆状虫体

A.Positive sample;B.Negative sample;a.Round shape;b.Ovoid shape;c.Rod shape

图1血液涂片镜检结果(姬姆萨，1 000×)

Fig.1 The microscopic examination results of blood smear (Giemsa，1 000×)

M.DNA标准DL 5 000;1～8.样品PCR产物；9.阳性对照；10.阴性对照

M.DNA Marker DL 5 000;1-8.PCR products of samples;9.Positive control;10.Negative control

图2泰勒虫特异性引物的套式PCR扩增结果

Fig.2 The nested PCR results usingTheileriaspecific primers

2.4 序列及遗传分析

将所有泰勒虫阳性样品序列通过Clustal X 1.83进行比对，去除两端不准确序列后获得的序列长度为1 275 bp，以XX18为代表的106个分离株基因序列与GenBank中T.luwenshuni的SSU rRNA基因(JN676988)序列同源性为99%，序列比对发现在59 bp及1 240 bp处分别发生了碱基颠换(T-G)、碱基转换(T-C)；以SH19为代表的6个分离株基因序列与该基因(JN676988)序列同源性为99%，序列比对发现在59、458、487、1 240 bp处分别发了碱基颠换(T-G)、碱基转换(G-A)、碱基转换(T-C)及碱基转换(T-C)(图3)。基于泰勒虫的SSU rRNA基因扩增的基因片段并利用NJ法构建了遗传进化树(图4)，发现所有阳性样品与T.luwenshuni参考序列归于一支。

3 讨论

羊泰勒虫病主要分布于热带及亚热带地区，在欧洲、中东、北非、南非及亚洲等地均有报道。自1958年杨辅国等[16]首次在我国四川境内报道泰勒虫病以来，我国共有19个省(市)报道了该病[13-14,17-18]。陕南白山羊主要分布于陕西南部地区，属北亚热带湿润气候，年平均气温在11 ℃以上，这样的气候和环境非常适合蜱类的生存和繁殖。羊只经蜱虫叮咬后便可引起羊泰勒虫病的流行。随着分子生物学的发展，PCR诊断以其高灵敏性和特异性逐渐被广泛应用[6,12]。本研究基于SSU rRNA将传统形态学检测与分子生物学相结合，对陕南白山羊中羊泰勒虫的感染情况进行了调查研究。

本研究首先利用形态学方法对采集到的羊血液样品制作血液涂片后进行姬姆萨染色，通过显微镜观察发现红细胞内存在圆点形、卵圆形或短杆状多形性虫体，虫体细胞核呈深染的紫红色，原生质呈淡染蓝色。这与之前李有全等[19]动物感染试验获得的结果一致。形态学检测要求操作人员不仅要熟悉泰勒虫的各种形态，还需区分其他血液原虫(如巴贝斯虫)的形态。由于SSU rRNA基因非常保守，其基因序列的差异大小代表了物种差异大小，因此，分析羊泰勒虫SSU rRNA基因并测序就可确定该物种分类地位，绘制其遗传进化树。通过遗传进化树分析发现，本研究所检测到的羊泰勒虫分布于T.luwenshuni所在的进化树分支上，且与参考序列的同源性均达到了99%以上。从构建的进化树可发现，本研究中的分离株与T.luwenshuni(GenBank登录号：JN676988、AF081136)位于同一分支，提示该研究中获得的泰勒虫种为T.luwenshuni。Li Y等[14]报道了湖北和河南羊泰勒虫的感染情况，其构建的遗传进化树表明，上述地区羊泰勒虫均为T.luwenshuni，这表明该泰勒虫种是这些地区的优势虫种。

图3 泰勒虫分离株SSU rRNA基因序列比对分析

图4 基于泰勒虫SSU rRNA基因序列构建的遗传进化树

进一步通过套式PCR对本研究中提取的血液DNA样品进行检测发现，121份样品中有112份结果呈阳性，阳性率达92.6%(112/121)，高于江苏(67.4%，116/172)[13]、新疆(4.1%，4/98)[13]、贵州(84.0%，42/50)[20]、甘肃(67.0%，351/524)[21]等地。可能是由于本研究中采样点多位于山地，且以半散养式养殖，加之饲养管理、消毒措施不够完善，是造成该地区羊泰勒虫感染率高的重要原因之一。此外，对本研究中不同年龄段羊泰虫感染率进行统计发现，12月龄内的羊只感染率为93.9%(46/49)，与大于12月龄的羊只(91.7%，66/72)差异不显著(P>0.05)。Ozubek S等[6]报道了土耳其山羊和绵羊的感染情况，发现大于12月龄羊只(49.6%)感染率显著高于小于12月龄羊只(28.5%)，这可能是由于不同的气候、品种、检测方法等因素造成的。

本研究结果表明，羊泰勒虫在陕南白山羊中感染率很高，且以T.luwenshuni感染为主。其结果不仅为该地区制定羊泰勒虫的综合防控措施提供参考和理论依据，也丰富了我国羊泰勒虫病流行病学资料。