系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中RSAD2表达及意义

曲婧格，王也，李熙萌，聂英坤

(哈尔滨医科大学附属第二医院，哈尔滨150086)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种可能致命并伴有多系统损害的自身免疫疾病，以产生大量自身抗体为特征，并通过抗原抗体免疫复合物沉积导致组织损伤，但确切的发病机制尚不明确。干扰素(IFN)是一种可以干扰病毒复制或传播的生物性蛋白质，包括Ⅰ型(IFN-α、 IFN-β等)、Ⅱ型(IFN-γ)及Ⅲ型(IFN-λ)三种类型[1]。近年研究表明，Ⅰ型IFN在SLE发病机制中起关键作用，IFN诱导基因如淋巴细胞抗原6复合体(LY6E)、IFN诱导蛋白1(IFIT1)在SLE患者PBMCs中显著升高，并与其疾病活动度有一定的相关性[2,3]。但在同样能被IFN诱导上调的系列基因中，S-腺苷甲硫氨酸基区域蛋白2(RSAD2)在SLE患者中的表达情况却鲜有报道。2017年10月～2018年2月，我们对SLE患者外周血单个核细胞(PBMCs)内RSAD2的表达进行检测，探讨其与SLE患者疾病活动度和免疫指标的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择同期在我院就诊的SLE患者46例作为SLE组，其中男3例、女43例，年龄11～69(45.56±15.35)岁。SLEDAI积分[5](5.9±3.9)分，其中高疾病活动度(SLEDAI积分≥6分)25例、低疾病活动度(SLEDAI积分<6分)21例。纳入标准：符合1997年美国风湿病学会(ACR)制定的SLE分类诊断标准[4]；外周血血清抗核抗体(ANA)、抗小核糖核蛋白(nRNP)抗体、抗Sm抗体、抗核小体抗体及抗Ro-52抗体、抗双链DNA(dsDNA)抗体、补体C3、补体C4资料完整。排除标准：并发淋巴增生性或除SLE外的自身免疫性疾病(如类风湿关节炎、干燥综合征和克罗恩病)、慢性感染疾病(如艾滋病)、活动性感染、经免疫抑制剂及糖皮质激素治疗。另选同期在我院进行健康体检的性别、年龄匹配的健康对照者33例作为对照组，其中男2例、女31例，年龄14～68(43.23±14.47)岁。收集SLE组外周血ANA、nRNP抗体、抗Sm抗体、抗核小体抗体及抗Ro-52抗体、dsDNA抗体、补体C3、补体C4资料。两组性别、年龄差异无统计学意义。本研究经哈尔滨医科大学附属第二医院伦理委员会批准，并取得受试对象的知情同意。

1.2 主要试剂 人外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；InvitrogenTMTRIzolTMReagent (Thermo Fisher Scientific)； Bulge-LoopTMmRNA qRT-PCR、M-MLV逆转录酶、SYBR Green、dNTP、DDT、RNase抑制剂、Oligo(dT)18、异丙醇、氯仿等(锐博生物科技有限试剂)。

1.3 PBMCs内RSAD2 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。抽取两组晨起空腹静脉血2 mL，加入EDTA抗凝管中，采用密度梯度离心法分离PBMCs，加入1 mL TRIzol，吹打至白色沉淀溶解后转入无酶EP管中，-80 ℃保存。取出已加入TRIzol的标本，室温解冻，依次加入氯仿、异丙醇、冰预冷的无水乙醇、无RNA酶DEPC水，充分溶解后于60 ℃中孵育5 min。进行逆转录反应，得到逆转录反应产物cDNA，并分别用无RNA酶的水稀释10倍。检索NCBI数据库，查到人类RSAD2基因的cDNA全长序列，以DNA STAR软件设计扩增模板的引物，以β-actin作为内参照基因。RSAD2上游引物5′-TTGGACATTCTCGCTATCTCCT-3′，下游引物5′-AGTGCTTTGATCTGTTCCGTC-3′；β-actin上游引物5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。各引物均由博尚生物技术公司合成。配置总体积为20 μL反应体系，PCR循环条件95 ℃ 20 s，95 ℃ 1 s、60 ℃ 20 s共40个循环，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s共40个循环。对RT产物的细胞拷贝数进行标准化，以2-ΔΔCt为相对表达量。按照2-ΔΔCt值将SLE患者分为高RSAD2表达、低RSAD2表达两个水平。

2 结果

2.1 两组RSAD2 mRNA表达水平比较 SLE组、对照组RSAD2 mRNA表达水平分别为8.4±10.7、1.7±1.4，SLE组RSAD2 mRNA表达水平高于对照组(P<0.01)。SLE组中高疾病活动度者、低疾病活动度者RSAD2 mRNA表达水平分别为11.4± 12.7、4.9 ±6.4，高疾病活动度者RSAD2 mRNA表达水平高于低疾病活动度者(P<0.01)。

2.2 不同RSAD2 mRNA表达程度的SLE患者免疫指标比较 46例SLE患者中，RSAD2高表达23例、低表达23例。RSAD2高表达者ANA、抗nRNP抗体阳性率均高于RSAD2低表达者(P均<0.05)。见表1。

2.3 SLE患者RSAD2表达水平与SLE特异性抗体水平的相关性 SLE患者RSAD2 mRNA表达水平与ANA(r=0.39，P<0.01)、抗nRNP抗体(r=0.31，P<0.05)均呈正相关，而抗Sm抗体、抗dsDNA抗体、抗核小体抗体、抗Ro-52抗体及补体C3、C4均无明显相关(P均>0.05)。

表1 不同RSAD2 mRNA表达程度的SLE患者免疫指标比较(例)

3 讨论

SLE是由环境致病因素、遗传风险因素等引起的一种常伴有靶器官损害的自身免疫性疾病，患病率和病死率呈持续增长，社会经济负担重，是一个严重的公共卫生问题。高疾病活动度是导致疾病进展的主要因素，其高疾病活动度严重影响患者的日常生活。早期或者临床前期发现及诊断可以显著改善或者治愈这种疾病，然而SLE的早期诊断仍是临床难题。近年研究发现，在SLE患者中Ⅰ型IFN的血清水平与病情活动呈正相关，IFN诱导基因与SLE发病密切相关，高IFN基因表达的SLE患者年龄较低，有着更高的抗dsDNA抗体或者低补体，病程较短且往往有着更高的活动性[6]。特别是Ⅰ型IFN系统，可通过对一系列下游基因的调控诱导自身免疫，因此研究Ⅰ型IFN诱导表达基因与SLE的关系具有重要意义。

RSAD2是Ⅰ型IFN介导的与内质网相关的病毒抑制基因，又被称作蝰蛇毒素(Viperin)或cig5，位于人类染色体2p25.2上，是一种有着广泛抗病毒活性的宿主蛋白质，近年研究表明，RSAD2与免疫反应密切相关，可用于预测类风湿关节炎的病情进展[7]。荟萃分析发现，RSAD2对SLE有重要的调控作用，在SLE中较正常对照表达明显升高[8]。进一步研究发现，SLE患者RSAD2的转录产物在CD3+、CD4+、CD19+B细胞及CD33+髓样细胞中较正常对照细胞表达明显升高[9]。同时，有基因芯片相关研究在筛选SLE患者与正常对照的差异表达基因中发现，RSAD2为显著上调的差异表达基因。进一步在小鼠B淋巴细胞中进行qRT-PCR验证，结果显示在SLE鼠B淋巴细胞中RSAD2较正常小鼠B淋巴细胞仍然显著上调[10]。本研究发现，SLE组RSAD2 mRNA表达水平高于对照组，SLE组高疾病活动度者RSAD2 mRNA表达水平高于低疾病活动度者，提示RSAD2表达升高可能与SLE的发生发展机制相关，并可以在一定程度上反映疾病的活动情况。

SLE的免疫异常涉及复杂的细胞间相互作用的过程，B淋巴细胞是SLE发病的直接参与者。抗原提呈细胞(APC)通过膜相关抗原受体(sIg、BCR)特异性捕获并提呈抗原，诱导B细胞活化，产生大量自身抗体，与自身抗原形成免疫复合物，通过Toll样受体配体，使B淋巴细胞处于高度活化状态。多种因素均可影响B淋巴细胞的免疫活性，如免疫调节机制缺陷、免疫耐受性丧失、信号转导异常等[11]。目前已经证实，SLE患者中存在B淋巴细胞受体信号通路的持续激活，基因分析显示B淋巴细胞受体信号通路存在基因表达缺陷和免疫效应分子异常[12,13]。B淋巴细胞除了分泌自身抗体外，还可以表达自身抗原，激活T淋巴细胞，产生促炎细胞因子，包括TNF-α和IL-6等[14]。以上多种机制共同影响了SLE的发生发展，而IFN诱导产生的RSAD2，作为一个抗病毒基因，有研究表明其在银屑病皮肤中过表达，其与IFNα诱导的抗病毒基因表达中的作用一致[15]，推测RSAD2的过表达与IFN诱导的其他基因共同在SLE发生发展中起着重要作用。SLE经典的筛选手段是通过检测血清ANA水平。本研究发现，SLE患者中RSAD2高表达者ANA、抗nRNP抗体阳性率均高于RSAD2低表达者，且SLE患者RSAD2 mRNA表达水平与ANA、抗nRNP抗体均呈正相关，提示RSAD2的过表达可协助SLE患者体内产生自身抗体，进一步表明其可能通过影响了B淋巴细胞的免疫活性，从而影响SLE的发生发展。

综上所述，SLE患者RSAD2的表达水平显著增高，并与疾病活动度及免疫功能相关，表明RSAD2具有作为SLE生物标志物的潜力，抑制RSAD2基因的表达也可能成为治疗SLE的一种新方向。