大黄素对肺炎链球菌肺炎小鼠肺组织炎症反应及p38 MAPK表达的影响

谢璟，王荣丽

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

肺炎链球菌是革兰阳性双球菌，正常情况下定植于人体上呼吸道，当人免疫低下或伴发病毒感染时，可发展成败血症、社区获得性肺炎、脑膜炎、中耳炎等。据统计，每年大约有160万人死于肺炎链球菌肺炎[1,2]。肺炎链球菌肺炎常选用抗生素治疗，然而，抗生素耐药肺炎链球菌正变得越来越普遍[3]。因此，研究非抗生素类药物治疗肺炎链球菌非常必要。大黄素是大黄、何首乌等的提取物，为蒽醌类衍生物，具有抗炎、抗病毒、抗微生物、利尿、舒张血管和抗癌等药理活性[4]。研究发现，大黄素可有效抑制多种细菌感染。近年研究发现，丝裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)信号转导通路参与了细胞增殖、分化、凋亡、炎症等，被认为是介导肺炎链球菌所诱导的肺组织炎症反应的关键信号分子[5]。2018年1～3月，我们观察了大黄素对肺炎链球菌肺炎小鼠肺组织炎症反应及p38 MAPK表达的影响，探讨大黄素对链球菌性肺炎的抗炎机制，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 清洁级健康雌性BALB/c小鼠32只，4～6周龄，体质量(18±1)g，购于重庆腾鑫生物技术有限公司。常规饲养2周后进行造模。肺炎链球菌标准菌株ATCC 49619购自广东微生物菌种保藏中心。水合氯醛(源叶)；大黄素(索莱宝)；西力欣(头孢呋辛酯片)；PBS溶液(ASPEN)；小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒(欣博盛)；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)；DAB显色剂；Western blotting相关试剂(武汉拜意尔生物科技有限公司)等。

1.2 细菌悬液配置 肺炎链球菌复苏后采用血琼脂培养基(50 mL/L CO2环境，37.0 ℃恒温)培育18 h，从琼脂平板表面刮下肺炎链球菌，悬浮于无菌的生理盐水中，用麦氏比浊法配制0.5号麦氏浊度的细菌悬液(细菌浓度约为1.5×108CFU mL)备用。

1.3 动物分组及模型建立 将32只小鼠随机分为对照组、模型组、大黄素组和头孢呋辛酯组，每只各8只。所有小鼠采用5%水合氯醛5 μL/g腹腔注射麻醉，模型组、大黄素组及头孢呋辛酯组按照文献[6]制备小鼠链球菌性肺炎模型，用无菌针头刺破鼻黏膜后，从鼻腔缓缓滴入0.5麦氏浓度菌液50 μL，待其自动吸入，前期经预实验行肺组织病理切片已证实模型成功。对照组刺破鼻黏膜后，从鼻腔滴入50 μL生理盐水。

1.4 干预方法 造模成功后第2天，每组进行灌胃治疗，给药剂量根据小鼠体质量按成人1 d剂量折算，换算公式参照文献[7]。大黄素组予以大黄素25 mg/(kg·d)灌胃，头孢呋辛酯组予以头孢呋辛酯50 mg/(kg·d)灌胃，对照组及模型组予以等量生理盐水灌胃，均灌胃1次/d，连续灌胃7 d。

1.5 肺组织病理观察 在末次给药12 h后，将各组小鼠均以5%水合氯醛麻醉，固定于解剖板，打开胸腔，暴露肺组织，分离并取出左肺，以4%多聚甲醛固定后，行脱水、包埋、切片，HE染色，光镜下观察肺组织病理学表现。

1.6 肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平检测 采用ELISA法。取右肺上叶，使用电匀浆机匀浆后，于4 ℃下，12 000 r/min离心15 min，取上清液，采用双抗体夹心法检测肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具体操作方法按照ELISA试剂盒说明。

1.7 肺组织p38 MAPK mRNA表达检测 采用聚合酶链式反应(PCR)。取右肺中叶于-80 ℃保存，取约100 mg肺组织，通过TRIzol法充分溶解提取组织总RNA。在逆转录酶的作用下进行反转录，之后再以cDNA为模板行PCR扩增。p38 MAPK引物、GAPDH引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成，序列如下：p38 MAPK上游5′-GGAGGTGCCCGAACGATAC-3′，下游5′-TTGGCGTGAATGATGGACTG-3′，扩增长度144 bp；GAPDH上游5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，下游5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′，扩增长度227 bp。结束PCR后，采用ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。

1.8 肺组织p38 MAPK蛋白表达检测 采用免疫印迹法(Western blotting法)。取右肺下叶-80 ℃保存，组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗，使用电匀浆机匀浆后，加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)，冰浴彻底匀浆。将匀浆液冰浴30 min后，于4 ℃、13 000 r/min离心5 min，取上清液。采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。

2 结果

2.1 肺组织病理表现 对照组肺泡结构完整，肺泡腔内无渗出物，肺泡间隔无增厚，间隔内毛细血管无明显充血、扩张充血及炎症细胞浸润。模型组可见肺泡腔内充满渗出的纤维素，肺泡结构破坏，肺泡间隔增厚及毛细血管扩张明显，肺间质见大量炎性细胞浸润。大黄素组可见肺泡腔内纤维素渗出较模型组少，部分肺泡结构破坏融合，部分肺泡间隔增厚，肺间质有少量炎症细胞浸润，可见少量红细胞。头孢呋辛组可见肺泡腔内少量纤维素渗出，部分肺泡间隔增厚，肺泡腔及肺间质有少量炎性细胞浸润，较模型组轻，可见少量红细胞。见图1。

注：A为对照组；B为模型组；C为头孢呋辛组；D为大黄素组。

2.2 各组肺组织上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 模型组肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平均较对照组增高(P均<0.05)，大黄素组、头孢呋辛组肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平均较模型组降低(P均<0.05)。见表1。

表1 各组肺组织上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

2.3 各组肺组织p38 MAPK mRNA表达比较 模型组p38 MAPK mRNA表达较对照组增高(P<0.05)，大黄素组p38 MAPK mRNA表达较模型组降低(P<0.05)。见表2。

2.4 各组肺组织p38 MAPK蛋白表达比较 模型组p38 MAPK蛋白表达较对照组增高(P<0.05)，大黄素组p38 MAPK蛋白表达较模型组降低(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组肺组织p38 MAPK mRNA及蛋白表达比较

图2 各组肺组织p38 MAPK蛋白表达水平(Western blotting法)

3 讨论

肺炎链球菌感染性疾病是引起5岁以下儿童死亡的首要原因。目前治疗链球菌性肺炎常选用抗生素治疗，然而，抗生素耐药性肺炎链球菌正变得越来越普遍。每年有120万新的肺炎链球菌感染病例，并且越来越多的肺炎病例是由至少对一种抗生素耐药的肺炎链球菌引起的。耐药菌株的涌现大大限制了抗生素的治疗效果，因此，对肺炎链球菌致病机制的深入研究及新药的开发应用迫在眉睫。

IL-1β、IL-6和TNF-α是促炎因子，可调节多种细胞的生理功能，并在创伤、疼痛、感染等应激过程中起重要作用。机体感染肺炎链球菌时，巨噬细胞活化，产生大量IL-1β、IL-6、TNF-α，它们相互协同[8]。IL-1β、IL-6、TNF-α还可以通过激活p38 MAPK信号通路，促进炎症因子的表达，扩大炎症反应。本研究发现，模型组肺间质大量炎性细胞浸润，肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平较对照组增高，提示肺炎链球菌可诱导小鼠发生强烈的炎症反应。

MAPK信号通路是细胞内重要的信号转导系统之一，参与细胞增殖、分化、凋亡、炎症等，与肺炎链球菌肺炎的发生密切相关[9]。目前在哺乳动物体内发现有4条MAPK通路，分别为p38 MAPK通路、c-JUN氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)通路、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通路和ERK5通路[10]。其中，p38 MAPK通路是信号转导枢纽，参与多种细胞信号转导。p38 MAPK信号通路可被多种应激刺激(热休克、H2O2、缺氧、放射线、紫外线等)、炎性因子[IL-1β、IL-6、TNF-α、人成纤维细胞生长因子(FGF)]、脂多糖(LPS)和革兰阳性细菌细胞壁成分激活，诱导巨噬细胞活化，促进IL-1β、IL-6、TNF-α等多种细胞因子的表达，介导炎症反应，并且活化p38 MAPK信号通路，可与ERK、JNK及核因子-κB(NF-κB)等信号通路发生正反馈，级联放大炎症反应[11～13]。Cao等[5]认为，p38 MAPK是肺炎链球菌所诱导的肺组织炎症反应的关键信号分子。Li等[14]研究发现，p38 MAPK信号通路可诱导肺炎链球菌小鼠巨噬细胞大鼠免疫应答。本研究发现，模型组肺组织p38 MAPK mRNA及蛋白表达均较对照组增高，结合模型组肺组织IL-1、IL-6、TNF-α水平较对照组增高，考虑p38 MAPK信号通路活化参与调控肺炎链球菌肺炎小鼠肺组织的炎症反应。

大黄素是大黄、何首乌等中药的提取物，现代研究表明，大黄素具有广谱抗微生物活性。Ferro等[15]发现，大黄素可抑制福氏志贺氏菌和化脓性链球菌引起的感染。大黄素对幽门螺旋杆菌具有抑菌作用，抑制效果呈剂量依赖性，进一步研究显示大黄素对幽门螺旋杆菌DNA损伤也呈剂量依赖性[16]。Su等[17]研究发现，大黄素能抑制金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、甲型链球菌等常见病菌甚至医院耐药菌感染，作用机制可能是破坏细菌细胞膜完整性。研究发现，大黄对包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌在内的12种微生物有抑菌效果，同时经大黄分离出的大黄素对这些微生物也具有抑菌效果，对链球菌的抑菌效果优于其他醌类化合物。

本研究结果显示，大黄素组肺泡腔内纤维素渗出较模型组少、肺间质炎症细胞浸润减轻，肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平较模型组降低，表明大黄素能抑制肺炎链球菌感染，减轻链球菌性肺炎的炎症反应，降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子水平；大黄素组p38 MAPK mRNA及蛋白表达水平均较模型组低，提示大黄素能抑制p38 MAPK mRNA及蛋白表达，表明大黄素可能通过抑制p38 MAPK信号转导通路的活化，从而减轻肺炎链球菌肺炎小鼠肺组织的炎症反应。