腺病毒与呼吸道合胞病毒肺炎患儿外周血淋巴细胞亚群差异分析*

付笑迎，秦 慧，郎家庆，杨方华，马东礼，陈运生

(1.深圳市儿童医院检验科，广东深圳 518038;2.蚌埠医学院，安徽蚌埠 233003)

儿童的呼吸系统发育尚未完全成熟，其机体自身免疫功能不完善，呼吸道极易受袭感染，急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection，ARI)是儿科常见疾病，其中病毒感染占相当大的比重，以腺病毒(adenovirus，ADV)及呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染为主，并呈一定的季节流行趋势，以冬春季节多发［1～3］。儿童感染病毒严重者会发展为肺炎，并引起各种并发症，甚至导致患儿死亡，后果不可想象［3］。我们前期的研究结果表明:在腺病毒感染的情况下，白细胞总数显著升高，且以中性粒细胞为主。而呼吸道合胞病毒感染的情况下，白细胞总数未见明显升高，且以淋巴细胞为主［5］。由此推测，免疫系统在病毒感染性疾病的发生发展过程中发挥重要作用。本文通过分析腺病毒及呼吸道合胞病毒肺炎患儿外周血淋巴细胞亚群的百分比变化差异，进一步认识病毒感染过程中淋巴细胞的比例变化，更好地了解免疫系统在病毒感染性疾病中的应答，为临床诊断儿童病毒感染性疾病提供更全面的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2014年1月～2015年12月临床诊断为急性呼吸道感染的住院患儿，根据直接免疫荧光法检测七项呼吸道病毒抗原水平，将60例病毒检测阳性患儿分为腺病毒阳性组(ADV组)30例，其中男性18例，女性12例，平均年龄18.12±8.26月;呼吸道合胞病毒阳性组(RSV组)30例，其中男性16例，女性14例，平均年龄7.55±12.78月。60例病毒感染患儿肺部听诊均可闻及中小湿啰音，肺部X线片有点状或片状阴影，临床诊断为肺炎，无其他病原感染的临床及实验室证据。并随机选取同期在保健科进行健康体检的婴幼儿35例作为健康对照组，其中男性20例，女性15例，平均年龄12.55±9.84月，三组的年龄和性别之间差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。经深圳市儿童医院伦理委员会审核同意，取得家长知情同意后对三组患儿及儿童的外周血进行流式淋巴细胞亚群检测。

1.2 试剂和仪器 流式抗体:抗人CD3-APC-Cy7，抗人CD4-FITC，抗人 CD8-APC，抗人 CD56-PECy7和抗人CD19-PE，购自美国BD ebioscience公司;红细胞裂解液，购自 Beckman公司;仪器:FACS CantoⅡ流式细胞仪，购自美国BD公司。

1.3 方法 淋巴细胞亚群的检测:在患儿入院当天即空腹抽取EDTA-K2抗凝血2 ml，健康对照组于体检当日抽取EDTA-K2抗凝血2 ml。每支试管内分别加入相应抗体(抗人CD3-APC-Cy7，抗人CD4-FITC，抗人CD8-APC，抗人 CD56-PECy7和抗人CD19-PE)和100 μl抗凝血充分震荡混匀，常温避光孵育15 min;再加入细胞裂解液200 μl混匀，室温孵育15 min，加PBS缓冲液洗涤2次，300 μl PBS缓冲液重悬混匀待检测。淋巴细胞亚群检测采用美国BD公司的FACS CantoⅡ流式细胞仪收集细胞检测荧光，计数10000～15000个淋巴细胞。并用Diva软件分析结果，分别得出CD3+T细胞，CD3+CD4+T细胞，CD3+CD8+T细胞，CD3－CD56+NK细胞及CD3－CD9+B细胞的百分比。

1.4 统计学分析 所有数据均来自于实验室信息管理系统(Lis系统)，数据用均值±标准差(珋x±s)%表示，采用SPSS13.0软件进行分析，多组中的两组间比较应用成组设计资料的t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果不同组间淋巴细胞亚群比例比较:见表1。

表1 不同组间淋巴细胞亚群百分比(%)的差异比较

ADV组与健康组相比，ADV组总CD3+T细胞比例显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)，其中以CD3+CD8+T细胞比例下降为主，差异亦具有统计学意义(P＜0.05)。与此同时，ADV组的CD3－CD19+B细胞百分比显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。RSV组与健康组间淋巴细胞亚群比较:总CD3+T细胞比例显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)，其中以CD3+CD8+T细胞比例下降为主，差异亦具有统计学意义(P＜0.01)。与此同时，CD3－CD19+B细胞亚群显著升高，且RSV组的NK细胞比例显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与ADV组相比，RSV组的NK细胞比例明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而其余各组淋巴细胞亚群之间的比例差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论支气管肺炎是儿科下呼吸道感染的常见病和多发病，儿童因其自身免疫系统未完全成熟，易发生急性呼吸道感染，其中病毒感染占相当大的比例，以呼吸道合胞病毒和腺病毒常见［6，7］。人免疫系统在婴幼儿病毒感染疾病发生发展过程中发挥着非常重要的作用，固有免疫和适应性免疫，细胞免疫和体液免疫都各司其职。细胞免疫中，T淋巴细胞扮演着重要角色，抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)通过MHC分子将内源性或外源性抗原肽呈递给T淋巴细胞，与T淋巴细胞膜表面受体特异性结合，激活T淋巴细胞，同时释放活性物质进一步活化巨噬细胞和B细胞，并分泌多种细胞因子，引起免疫损伤。活化的CD8+T细胞能够在MHC限制的条件下，通过脱颗粒作用，迅速释放细胞内预存的穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)，发挥杀伤靶细胞的免疫应答作用;还能通过释放即时合成的细胞因子以及趋化因子等发挥免疫调节作用。与CD4+T辅助细胞相似的是，CD8+T细胞在不同的细胞因子诱导条件下，亦可以分化为不同的Tc细胞亚群，表达不同的特异性转录因子，并发挥不同的免疫应答作用。目前发现的有Tc1细胞，Tc2细胞和Tcreg细胞等，研究表明，Tc1，Tc2细胞以及CD8+CD25+Foxp3+调节性T细胞都参与了病毒感染性疾病的发生发展过程，并在其中发挥重要的免疫应答效应［9］。我们的研究结果提示CD8+T细胞百分比有所下调，提示我们病毒性肺炎患儿外周血中的CD8+T细胞的免疫应答状态发生变化，病毒感染时机体通过增强细胞免疫功能来发挥抗病毒作用。

B淋巴细胞是机体适应性免疫系统的重要组成，B细胞的主要功能即为产生免疫球蛋白(Ig)，介导体液免疫应答;此外，B细胞还能够分泌细胞因子(如IL-4，IL-5，IL-6和 TNF 等)，且具有将抗原递呈给初始T细胞的潜能［9］。我们的研究结果提示病毒性肺炎患儿外周血B淋巴细胞亚群比例明显增高，提示我们体液免疫应答在机体对抗病毒过程中发挥重要作用，亦有研究表明呼吸道合胞病毒特异性抗体IgM，IgG和IgA不能单独作为早期感染呼吸道合胞病毒的诊断指标［10］。

人自然杀伤细胞(NK细胞)是固有免疫系统的重要组成部分，是机体自身发挥抗病毒作用的免疫先锋，在无预先致敏的情况下迅速杀伤靶细胞并释放多种细胞因子 (如 IFN-γ，TNF-α，GM-CSF等)，为机体提供快速的防御保护作用［11］。我们的研究表明，在腺病毒肺炎患儿的外周血中，NK细胞的比例有所下降，提示我们NK细胞在病毒感染过程发挥了其效应功能。近来的研究提示人的体内存在多种类型的固有淋巴细胞(innate lymphoid cells，ILCs)，ILC发育分化早期存在着共同前体，在后期阶段受不同转录因子调控，不同ILC亚群有着不同的细胞因子分泌谱［11］。根据杀伤功能强弱，ILC可以被分为两类:一类是具有较强杀伤活性的NK细胞，另一类是不具备或仅有较弱杀伤能力的辅助性ILC。有研究发现，重症肺炎患儿比轻症患儿NK细胞降低更为显著［12］，而辅助性ILC细胞亚群在病毒性肺炎患儿的病程中扮演怎样的调控角色还有待进一步研究。

综上所述，病毒性肺炎患儿免疫细胞亚群发生变化，且存在淋巴亚群紊乱，不同类型的病毒感染引起患儿外周血淋巴细胞亚群的变化亦不同，临床可通过检测患儿外周血T淋巴细胞亚群，NK细胞及B细胞的亚群比例变化，反映患儿机体的免疫状态，为患儿的诊断提供免疫依据。