热损伤/热习服大鼠血清中microRNA-193a-3p的表达及与相关细胞因子水平的相关性*

龙曙萍，李腾达，刘 云，郭 杰，张薇薇，谷明莉，邓安梅

(海军军医大学长海医院，上海 200433)

热相关疾病(heat-related illness)是指机体暴露在高温环境中而产生的一系列生理问题，导致身体核心温度的升高且超过体温正常代偿范围［1］。热相关疾病包括轻微热相关疾病(热水肿、热痉挛和热晕厥等)和热休克损伤(heat stroke，HS，也称中暑)，其中热休克损伤是最常见的热相关疾病［2］，严重的热休克损伤会导致酸中毒和细胞缺氧［3］。热休克损伤包括劳力性中暑和经典型中暑，前者多由体力劳动诱导，多发于年轻的运动员和体力劳动者;后者多与气候和湿度相关，多发于少儿和老人等体弱者［4］。热习服(heat acclimatization，HA)定义为机体对核心温度升高的生理和感知适应性，即高温耐受性［5］。在热习服过程中，基因和蛋白的表达会发生一系列变化［5］。

microRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，通常位于相应 mRNA的3’非翻译区(3’UTR)，对编码蛋白质的靶基因mRNA发挥抑制作用［6］。miR-193a编码基因(mIR193a)位于染色体17q11.2，能够抑制正常细胞的增殖和细胞周期［7］。miR-193a-3p在多种肿瘤中发挥着抑制肿瘤的作用。有研究表明，在急性白血病患者分离的造血干细胞中，miR-193a-3p与PTEN/PI3K信号通路协同作用并促进白血病发生［8］。在溃疡性结肠癌患者中miR-193a-3p下调，并通过上调IL-17RD促进癌症发生［9］。但目前未有miR-193a-3p在热休克损伤方面的研究报道，而miR-193a-3p在热损伤疾病中的变化和临床意义也不明确，因此本实验通过分析热损伤/热习服大鼠血清中miR-193a-3p的变化及其与相关炎症因子的关系来探讨其在热相关疾病发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究对象 实验大鼠购买并饲养于海军军医大学实验动物中心，成年雄性SD大鼠，6～8周龄，200～250 g，个体间体重和肛温基本一致。每日光照时间为7∶00～19∶00，大鼠自由进食和饮水。为减少环境变化对动物的影响，所有动物预先饲养一周，然后进行实验。

1.2 试剂与仪器 体温计，离心机(日本Hitachi)，PCR 仪(美国 Applied Biosystems)，ELISA 试剂盒(美国eBioscience)，酶标仪(美国Thermo Scientific)，Trizol(美国 invitrogen)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠热损伤/热习服模型的建立:45只实验大鼠随机分为3组:热损伤(HS)组，热习服(HA)组和对照(HC)组。HS组大鼠置于温度(43±0.5)℃，湿度(70±5)%的智能模拟实验舱中120 min，大鼠在实验舱内自由活动，禁止饮水与进食，每隔10 min测定一次肛温，肛温＞42.5℃认为达到HS，记录达到HS的时间。HA组大鼠置于温度(34±0.5)%，湿度(70±1)℃的实验舱中 30天，每天9∶00am测量大鼠肛温，大鼠自由进食与饮水。HC组正常饲养。

1.3.2 采血与分离血清:大鼠称重后，按照300 mg/kg为单位腹腔注射水合氯醛。麻醉后迅速进行心脏采血，3599 r/min离心5 min分离血清。取1 ml血清用于细胞因子和蛋白的检测，剩下的加入Trizol用于提取RNA。

1.3.3 microRNA提取:反转录与qRT-PCR:按照Taqman microRNA Assays说明书检测microRNA的表达水平。用反转录试剂盒将microRNA反转为cDNA，以cDNA为模板，GAPDH为内参，设立平行对照组2组，重复组3组，于ROCHI 4800上进行qRT-PCR。热休克蛋白 70(heat shock protein，HSP70)与细胞因子的检测:按照ELISA试剂盒说明书检测血清中的热休克蛋白70(HSP70)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α) 和转化生长因子(transforming growth factor-β)的表达水平。

1.4 统计学分析 数据符合正态分布采用均值±标准差(珋±s)的形式表示，不符合正态分布采用中位数和四分位间距来描述数据的集中趋势和离散趋势。实验组与对照组之间的比较采用Dunnett-t检验，P＜0.05表示两变量之间差异具有统计学意义。以Pearson相关性分析来比较两变量之间的相关性，检验水准 α为0.05。统计软件为 IBM SPSS statistics21.0和 Graghpad Prism6.0。

2 实验结果

2.1 microRNA-193a-3p在大鼠血清中的表达microRNA193a-3p在 HS，HA和 HC组中分别为0.99±0.30，1.13±0.33 和 2.15±0.35。microRNA-193a-3p在HA和HS组中的表达与对照组相比显著降低且差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 大鼠血清HSP70及相关细胞因子的表达见表1。HS组、HA组与HC组的HSP70和细胞因子的比较采用 Dunnett-t检验，HSP70，IL-1β，TGF-β和TNF-α在HS组中的表达与HC组相比显著增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，HSP70，IL-1β 和TNF-α在HA组中的表达与HC组相比显著增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 大鼠血清中HSP70及相关细胞因子的表达情况(珋±s)

表1 大鼠血清中HSP70及相关细胞因子的表达情况(珋±s)

项 目 HS HA HC P HS vs HC HA vs HC HSP70(pg/ml)IL-1β(ng/ml)TNF-α(pg/ml)TGF-β(pg/ml)617.19±21.6254.29±5.60208.14±11.33119.56±17.39361.19±26.3031.19±3.57111.44±9.4685.76±9.32327.21±28.4924.73±3.3993.34±4.2092.30±8.94＜0.001＜0.001＜0.001＜0.0010.001＜0.001＜0.0010.27

2.3 HS组，HA组microRNA-193a-3p与HSP70和细胞因子的相关性分析 见表2。在HS组中，microRNA-193a-3p与 HSP70，IL-1β 和 TNF-α 呈显著负相关(r=－0.821，－0.839，－0.578，均P＜0.05)。在HA组中，microRNA-193a-3p与HSP70，IL-1β 呈显著负相关(t=－0．770．－0．766，均P＜0.05)。

表2 HS组，HA组microRNA-193a-3p与HSP70和细胞因子的相关性分析

3 讨论随着全球极端天气出现的次数增多，热损伤疾病的发病率和死亡率增加。热休克是一种对高温的系统性炎症反应，循环衰竭导致多器官衰竭和中枢神经系统功能紊乱。当机体体温升高到一定程度时，细胞的代谢产物增多且循环衰竭，导致体内有害物质堆积、组织功能紊乱和损伤［4］。此外，从肠系膜漏出的内毒素增多，而热损伤导致肝细胞功能受损并且肝静脉血流减少，因此增加的内毒素不能在肝内很好的失活并解毒，继发内毒素血症，并诱导机体产生多种细胞因子。而产生的炎性细胞因子又进一步导致低血压、循环衰竭和核心体温增加［4］，如此周而复始，恶性循环。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是首次在遭受热应激的果蝇中发现的进化高度保守的基因，热休克蛋白是一组催化新生蛋白和变性蛋白正确再折叠的分子伴侣［11］。HSP70是研究最多的与热损伤相关的热休克蛋白［11］。新生的HSP70在高温下热力学稳定并迅速执行分子伴侣的功能，尽量减少热休克反应和损伤［12］。Pre-miRNA-193a(miRNA-193a 前体)产生两种成熟的 miRNA:miRNA-193a-3p和miRNA-193a-5p。miRNA-193a-3p是肿瘤抑制miRNA，通过作用于靶基因对肿瘤的增殖、凋亡、转移和侵袭发挥重要作用［7］。在急性白血病中，miRNA-193a-3p下调促进融合蛋白AML-ETO的致瘤性，因为miRNA-193a-3p抑制很多靶基因如:AML1/ETO，DNMT3a，HDAC3，KIT，CCND1 和MDM2的表达［8］。在溃疡性结肠炎病活动期，miRNA-193a-3p作为PepT1的靶基因通过减少PepT1的表达而抑制NF-κB信号通路，因此阻断肠道微生物产物诱导的肠道固有免疫反应［10］。在寄生虫诱导的感染免疫小鼠模型中，编码IL-1β，TNF-α，IFN-γ和 NF-κB的 mRNA表达上调，而 miRNA-193a-3p表达下调［13］。有研究表明 microRNA let-7b在热射病大鼠血清中的表达增高，且与细胞因子 HSP70，TNF-α 和 IL-6 呈正相关［1］。因此，miRNA-193a-3p和IL-1β，TNF-α之间是否也存在某种关系?随着miRNA-193a-3p在肿瘤中的研究被关注，我们想知道miRNA-193a-3p在热损伤/热习服中的表达和相关调控机制。本研究发现在热损伤大鼠模型中，血清中miRNA-193a-3p的表达显著低于对照组，且与HSP70，IL-1β和TNF-α呈负相关。证明miRNA-193a-3p可能参与热相关疾病的发病机制，这为临床诊断热相关疾病提供潜在的指标。但本实验仅限于动物模型，需要进一步在病人身上进行临床验证和深入研究其在疾病发生发展中的作用。