中药肠乐口服液对大肠杆菌O 161抑菌和抗炎效果观察

2018-08-21邢玉娟曹希敏王建国李其虎许祎然徐玉凤陈玉库

中兽医学杂志 2018年7期

邢玉娟 ,杨帆，刘益，曹希敏，王建国，李其虎，许祎然，徐玉凤，陈玉库

（1.江苏农牧科技职业学院,江苏泰州225300；2.南京农大动物药业有限公司,江苏南京210000；3.威海市环翠区动物疫病预防控制中心,山东威海264200）

猪大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌引起的一类仔猪肠道传染病的总称，包括仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病，常常引起大批仔猪生长不良或死亡，业己成为现代养猪业的一大障碍[1,2]。由于耐药菌株的普遍性，造成许多原来防治本病有效的抗生素现在某些猪场已无明显效果，反而使应用剂量不断地加大[3,4]。肠乐口服液是江苏南京农大动物药业有限公司研制的纯中药制剂，实验性临床试验和中试产品的扩大性临床试验均证明，临床应用该方剂防治仔猪腹泻疗效确切，不良反应少。本研究通过小鼠耳廓肿胀试验、体外抑菌试验等证明肠乐口服液的抗炎和抑菌功效，以探讨肠乐口服液治疗大肠杆菌感染性疾病的药理作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物

肠乐口服液，南京农业大学动物药业有限公司提供，100ml/瓶，1.0g生药 /ml，批号20170805。

白头翁口服液，3ml/瓶，河北华润动物药业有限公司，批号：兽药字（2008）030196500。

1.1.2 试验菌株

大肠杆菌菌株（临床强毒菌株）：O161，由扬州大学兽医学院微生物实验室提供。1.1.3主要试剂和器材

1.1.3.1 主要试剂 LB固体培养基、LB液体培养基、营养琼脂培养基；二甲苯（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3.2 主要器材比浊仪（法国生物梅里埃公司）、超净工作台（SW-CJ-1FD苏州净化设备有限公司）、手提式灭菌锅（河北华泰设备医疗有限公司）、恒温培养箱、电热恒温干燥箱（上海一恒科技有限公司）、电子天平（BX320S，上海精密仪器仪表有限公司）等。

1.1.4 试验动物

ICR小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由扬州大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为SCXK （苏）2007-0001，使用许可证号为SYXK（苏）2007-0005。

1.2 方法

1.2.1 抑菌试验

1.2.1.1 菌液的制备取冻存的大肠杆菌O161，于LB固体培养平板上进行三区划线，37℃培养。挑取单个菌落，接种于新鲜的LB液体培养基中，根据预实验结果（即OD=1时，1ml菌液中菌液浓度为5.9×108cfu/mL），将菌液浓度调整至1×106cfu/ml，备用[5]。

1.2.1.2 中药药敏试验无菌条件下，取供试菌液100μL滴入培养基表面，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面，用灭菌的打孔器（直径为6 mm）在每个平皿培养基上打孔。将药液滴满孔，静置30 min后平稳转入37℃培养24 h，取出测量抑菌环直径，取平均值。每种药物重复3次。抑菌效果判定标准:抑菌直径≧20 mm为极敏，15-19 mm为高敏，10-14 mm为中敏，10 mm以下为低敏[6]。

1.2.1.3 最低抑菌浓度（MIC值）的测定

采用试管二倍稀释法[7]。取灭菌具塞试管10支，编号排列于试管架上。每支试管加入2 mL营养肉汤培养基，于第1支试管中加入2 mL供试品原液，混合均匀，取2 mL加入第2支试管中，振摇混合均匀后，取2 mL加入第3个试管中，依此类推，直到稀释到第8个试管，将第8支试管混合均匀后，从中取出2 mL弃去，得到肠乐口服液的浓度分别为 0.5 g/ml、0.25 g/ml、0.125 g/ml、0.0625 g/ml、0.0312 g/ml、0.016 g/ml、0.008 g/ml、0.004g/ml。将准备好的菌液加入至上述各试管中，每支试管分别加入0.1 mL，作为试验组。第9支试管不加供试药物，加入2 mL营养肉汤培养基和0.1 mL的供试菌悬液，为阳性对照。第10支试管加入营养肉汤培养基2 mL，再加入供试品原液2 mL，不加菌液，为阴性对照。将试验组、阳性对照组、阴性对照组各管置37℃的培养箱中培养24 h，取出，观察。在阳性对照管细菌生长正常、阴性对照管无菌生长的条件下，营养肉汤未发现浑浊的最低稀释浓度即为该样品的最低抑菌浓度（MIC）。

1.2.2 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

小鼠50只，雌雄各半，按性别、体重随机分5组，每组10只，肠乐口服液高剂量组（10g/kg）、中剂量组（5.0 g/kg）、低剂量组（2.5 g/kg），药物对照组（白头翁口服液5.0 g/kg），阳性对照组。各给药组灌胃给药，每次0.1 mL/10g，每天1次，连续3 d，阳性对照组用等量的生理盐水灌胃。于末次给药30 min后，用二甲苯棉球接触小鼠左耳约5 s，15 min后脱颈椎处死，手术剪剪下小鼠双耳，用打孔器（直径7 mm）在左右耳相对称部位打下耳片，电子天平称重，记录其重量，以左耳重减右耳重为小鼠的耳肿胀度[8]。

2 结果

2.1 体外抑菌试验

2.1.1 中药药敏试验

由表1可以看出，肠乐口服液的抑菌环直径为12 mm，根据药物敏感判断标准为中敏；对照药物白头翁口服液抑菌直径为16 mm，药物敏感性为高敏。

表1 药物抑菌作用结果

2.1.2 最低抑菌浓度（MIC值）

由表2可看出，肠乐口服液对细菌的MIC为0.125 g/ml，对照药物为 0.0625g/ml。

2.2 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

肠乐口服液高、中、低剂量组和药物对照组均能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀，与空白对照组相比差异显著(P＜0.05)，其中，肠乐口服液高剂量组效果最好，与阳性对照组效果相当。见表3。

表3 肠乐口服液对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(±sD，n=10)

3 讨论

体外抗菌试验显示，肠乐口服液对临床强毒菌株大肠杆菌菌株O161有中等程度的抑菌作用，最低抑菌浓度MIC为0.125 g/ml。试验结果表明，中药复方对大肠杆菌显示抑制作用，这与庞载元等人的研究结果一致[9,10]。

二甲苯作为一种化学致炎剂，因操作简便常被选择作为药理试验抗炎作用的造模致炎剂[11]。试验结果显示，与阳性对照组相比，肠乐口服液高、中、低剂量组均能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀(P＜0.05)，其中，高剂量组效果最好，与阳性对照组效果相当。

中兽医学认为，仔猪大肠杆菌病多由母体藏伏的温热疫毒，母病及子，或初生仔猪卫阳稚嫩，易感外界湿热毒邪而为病。湿热蕴结大肠，损伤肠道，致其清浊不分而出现腹泻下痢[12]。肠乐口服液由杨树花、厚朴酚、藿香油等组成，功能清热解毒，燥湿止痢，本试验证明能对临床强毒菌株大肠杆菌菌株O161有中等程度的抑制作用，并能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀，显示很好的抑菌和抗炎作用。