儿童哮喘糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ多态性及其对激素疗效的影响

陈海燕

(胜利油田中心医院，山东东营257034)

儿童哮喘是一种由肥大细胞、中性粒细胞等炎性细胞及组分参与的异质性气道疾病，临床表现以过敏性喘息等症状为主，发病机制较复杂，发病诱因多与环境及遗传因素有关[1,2]。目前,吸入糖皮质激素是儿童哮喘患者治疗的首选药物，然而不同患者对吸入糖皮质激素的疗效具有明显的个体差异，这种个体敏感性的不同与糖皮质激素受体基因的多态性有关[3,4]。本研究拟以山东东营地区儿童哮喘患者为对象，分析糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ单核苷酸多态性(SNP)及其是否对激素疗效有影响，为探讨儿童哮喘发病机制及治疗策略提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取2014年10月～2017年6月在胜利油田中心医院儿科门诊就诊的哮喘患儿285例(哮喘组)，符合2006年GINA儿童哮喘诊断标准。其中男185例、女100例，年龄3～12(4.7±1.5)岁，患儿1个月内未使用糖皮质激素。家长均签署知情同意书。对照组选取胜利油田卫生学校223例本人及三代以内直系亲属中无哮喘史、无肺部其他疾病史、无变态反应史的健康学生志愿者，其中男113例、女110例，年龄3～12(4.7±1.5)岁。

1.2 治疗方法 根据患儿跟踪随访，选取具有良好依从性哮喘组患儿120例，初始雾化吸入布地奈德混悬液1 mg+特布他林雾化液2.5 mg(或5 mg)雾化吸2次，持续治疗15 d。维持期治疗根据前1、3、6个月评估降阶梯治疗，调整布地奈德吸入量，最低剂量维持0.25 mg/d。

1.3 观察指标与疗效评定 分别在吸入布地奈德治疗满1、3、6个月时对入组患儿进行门诊或电话随访，观察哮喘患儿的日间症状、夜间症状、急性发作情况、应急药物的使用、活动受限情况。评定标准：根据3次随访情况，按照哮喘急性发作次数进行分组，分为低效：出现>1次急性发作；高效：出现≤1次急性发作。

1.4 糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ SNP分析 分别采集哮喘组受试患儿与对照组口腔颊黏膜拭子，利用试剂盒提取基因组DNA，测定DNA浓度，-20 ℃保存备用。采用Taqman探针法对患儿基因组DNA样本糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ SNP位点进行基因分型。根据位点的RS序号设计并合成Taqman引物与MGB探针各2条，探针分别使用FAM和VIC标记。采用PCR反应混合体系10 μL进行PCR扩增反应，然后在ABI 7900实时荧光定量PCR仪中进行终点读板，由ABI SDS 2.3软件判断得出基因型。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。Hardy-Weinberg平衡吻合度检验研究样本的群体代表性；计数资料以频次或百分比表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡吻合度检验 对bcl-Ⅰ SNP位点在哮喘组与对照组中进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，P>0.05，表明糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ SNP位点在受试群体中处于遗传平衡状态，具有群体代表性。

2.2 两组糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ基因型频率及等位基因频率比较 糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ共有3种基因型：CC纯合型、GG纯合型和CG杂合型。哮喘组中CC纯合型基因型频率高于其余两种，GG纯合型基因型频率、G等位基因频率高于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 两组糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ基因型频率及等位基因频率比较

2.3 不同bcl-Ⅰ基因型哮喘患儿的治疗效果 对120例不同基因型哮喘患儿进行治疗后发现，CC型患者高效52例、低效11例，高效率82.5%；GG型患者分别为10、16例，高效率38.5%；CG型患者分别为15、16例，高效率48.4%。CC型患者高效率高于GG型患者与CG型患者(χ2值分别为16.92、11.84，P均<0.05)。

3 讨论

儿童哮喘是由多种细胞及其组分参与的气道反应性炎症疾病，其发病机制多与关键调控因子的基因突变有关[5,6]。目前吸入糖皮质激素是儿童哮喘患者长期治疗的首选药物，可有效控制哮喘症状、改善肺功能、降低气道高反应性，减少患者急诊和住院次数，并可望防止儿童哮喘迁延为终身疾患。然而糖皮质激素受体基因的变异可降低该受体对糖皮质激素的敏感性，形成激素依赖，这是难治性哮喘的一个重要原因[7]。SNP是人类细胞增殖发育过程中基因组DNA最常见的变异形式之一，因此对糖皮质激素受体关键基因的SNP分析是探讨儿童哮喘及治疗策略的重要方法[8]。

糖皮质激素的生物学作用需通过其受体介导实现。糖皮质激素受体是一种由配体激活的核转录因子，其编码基因包含有10个外显子，所表达的糖皮质激素受体可与扩散进入胞质内的糖皮质激素相结合形成复合物，进而进入细胞核中，结合并调控靶基因的转录活性，发挥生物学效应[9]。而糖皮质激素受体编码基因的突变则会导致受体蛋白结构或表达异常，从而影响其与糖皮质激素的结合活性，降低糖皮质激素治疗的敏感性，产生激素抵抗效应[10,11]。

目前，国内外学者对于糖皮质激素受体基因SNP的研究主要集中于bcl-Ⅰ、ER22/23EK与N3635等3处位点，不同区域不同人种间研究结果不尽相同[11]。bcl-Ⅰ位点多态性是指位于糖皮质激素受体基因外显子2下游646核苷酸处的位点突变，C突变为G(TGATCA突变为TGATGA)[12]。对于糖皮质激素受体bcl-Ⅰ位点多态性的研究最早出现于胰岛素抵抗相关研究中，随后的研究表明，bcl-Ⅰ SNP也与气道阻塞及肺纤维化等疾病相关[13,14]。Anja等[15]发现，bcl-Ⅰ SNP与吸烟人群气道变异严重程度有关。同时，bcl-Ⅰ SNP也与肺组织纤维化病变过程中炎性反应的发生及肺功能的恶化有关[13]。云哲琳等[12]研究表明，糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ多态性也与哮喘发生存在相关性。本文以山东东营地区儿童哮喘患者为对象，证实了糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ基因型频率分布与正常儿童存在差异，其中G等位基因频率较高，表明糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ G等位基因突变与该地区儿童哮喘相关。

此外，本文对糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ不同基因型的哮喘患儿进行了激素治疗，发现CC型患者治疗效果好于GG型患者与CG型患者。由此认为，哮喘患儿对糖皮质激素治疗敏感性降低的主要原因可能是糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ G等位基因的突变导致了糖皮质激素受体蛋白结构或表达量发生改变。哮喘的发生受基因突变及环境因素共同影响，糖皮质激素受体基因的多态性研究对于哮喘易感及治疗方式的选择等均具有指导作用，具体临床应用还需以后进一步多中心大样本研究进行确认。

综上所述，山东东营地区儿童哮喘糖皮质激素受体基因bcl-Ⅰ G等位基因突变；CC基因型哮喘患儿对于激素治疗的敏感性高于GG与CG基因型。该发现为探讨儿童哮喘发病机制及治疗策略提供了依据。