结直肠癌组织ERCC1表达水平对患者术前XELOX方案新辅助化疗疗效的影响

叶善平，李太原，钟武，张磊，方传发，夏来阳

(1 赣州市人民医院，赣州341000；2南昌大学第一附属医院)

结直肠癌(CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤，对人类健康存在严重威胁，临床确诊时多处于中晚期[1]。治疗方案仍是以手术为主的综合治疗模式，其中术前新辅助化疗的重要性受到越来越多重视，可以提高根治切除率和延长患者生存期，但同一方案在不同个体间疗效却大相径庭[2]。大多数化疗药物阻止肿瘤的生长是通过破坏肿瘤细胞的DNA，而肿瘤细胞却可通过增强DNA修复来产生耐药。DNA切除修复交叉互补基因-1(ERCC1)是与DNA修复密切关联的基因，与肿瘤的耐药相关[3]。相关研究显示，肺癌、头颈部癌、胃癌等恶性肿瘤中，ERCC1表达升高提示患者对铂类化疗药物的疗效较差[4, 5]。本研究通过RT-qPCR技术检测化疗前结直肠癌组织内ERCC1 mRNA水平，分析其与结直肠癌患者术前XELOX方案新辅助化疗疗效的相关性，为临床个体化治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2012年6月～2014年8月在南昌大学第一附属医院经病理证实为结直肠癌的42例初治患者的新鲜肠镜标本(癌组织及癌旁正常组织)，临床病理资料完整，知晓并同意行术前XELOX方案新辅助化疗，美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分≤2分，已通过医院伦理委员会审核。42例患者中男25例、女17例，年龄31～64岁、中位年龄49岁。

1.2 治疗方法 患者均接受3个周期奥沙利铂+卡培他滨(XELOX)方案术前新辅助化疗。按体表面积给药(奥沙利铂130 mg/m2，静滴2 h，第1天；卡培他滨1 000 mg/m2，口服，2次/d，第1～14天)，3周后重复。化疗结束后第4周复查增强CT、MRI和肠镜，采用RECIST实体瘤疗效评定标准[6]评价疗效，完全缓解(CR)和部分缓解(PR)为有效组，病情稳定(SD)和疾病进展(PD)为无效组。

1.3 组织中ERCC1 mRNA表达水平的检测 采用RT-qPCR法。48例患者均初诊时取肠镜活检组织4块迅速置入经DEPC水(1 g/L)处理过的EP管中,标记后放入液氮罐保存。①总RNA提取：42例样本均冰冻切片6张，光学显微镜标记肿瘤密集区，以确保有足够的RNA，采用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)提取总RNA，取RNA提取液2 μL，用紫外分光光度计UV-2800AH检测RNA浓度，OD260/OD280比值1.8～2.0；②基因组cDNA合成：采用TaKaRa RR047A(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)逆转录试剂盒，按试剂盒说明书步骤把上述总RNA逆转录成cDNA，反应液于-20 ℃保存。③qPCR：采用TaKaRa RR420A(SYBR@ Premix Ex Taq)试剂盒，PCR反应体系为20 μL：SYBR@Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) 10 μL，PCR Forward/ Reverse Primer各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，上述cDNA 2.0 μL，dH2O 6.8 μL，样品管和内参管均设3个复管。使用ABI StepOnePlusTM型荧光定量PCR仪进行qPCR反应，反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 个循环；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。其中ERCC1和β-actin引物序列在Genbank数据库查找，用Premier 5.0软件设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。目的基因ERCC1正向引物5′-GGGAATTTGGCGACGTAA-3′，反向引物5′-GCGGAGGCTGAGGAACA-3′；参照基因β-actin正向引物5′-GAGCGCGGCTACAGCTT-3′，反向引物5′-TCCTTAATGTCACGCACGA-3′。逆转录试剂盒、PCR试剂盒均购自TaKaRa公司。ABI StepOnePlusTMSDS Software自动分析荧光信号并将其转换Ct值。Ct值取三个复管的平均值。ΔCt=目的基因Ct值-内参Ct值的差值，ΔΔCt=ΔCt-(阴性对照样品Ct值-内参Ct值)，基因相对表达量以2-ΔΔCt表示。

2 结果

2.1 结直肠癌患者XELOX方案新辅助化疗疗效 接受3个周期化疗者42例，其中CR 2例、PR 22例、SD 7例、PD 11例，化疗有效率为57.14%。有效组24例，无效组18例。

2.2 结直肠癌组织及癌旁正常组织中ERCC1表达水平比较 结直肠癌患者癌组织中均有ERCC1 mRNA表达，扩增曲线呈现典型的S型，溶解曲线呈单峰状，排除了非特异性扩增，表达水平0.92～6.53，均值约为3.10。癌旁正常组织表达水平2.14～7.88，均值为4.9。两者比较,P<0.05。

2.3 癌组织中ERCC1表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系 ERCC1 mRNA表达水平与结直肠癌患者性别、年龄、分化程度、是否穿透脏层腹膜、肿瘤大体类型、ECOG评分无关(P均>0.05)，与淋巴转移有关(P<0.05)。见表1。

表1 癌组织中ERCC1表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系

2.4 淋巴结转移与结直肠癌患者化疗疗效的关系 淋巴结有转移的结直肠癌患者新辅助化疗有效率为53.3%(16/30)，淋巴结无转移患者的化疗有效率为66.7%(8/12)。两者比较,χ2=0.622,P>0.05。

2.5 ERCC1表达与结直肠癌患者化疗疗效的关系 有效组ERCC1 mRNA表达水平为2.332±0.370，无效组为4.113±1.673。有效组低于无效组(P<0.05)。

3 讨论

目前，新辅助化疗已成为治疗中晚期结直肠癌的主要方法，主流化疗方案以氟尿嘧啶类药物及铂类药物为基础。相关研究显示，相同病理特征的患者接受相同方案化疗，疗效差异较大[7]。随着分子生物学进展，研究发现消化道肿瘤患者的预后与癌基因和(或)抑癌基因异常表达密切相关。其中ERCC1为近年来临床关注较多且也颇有争议的一项指标。本研究探讨了肿瘤分子标志物ERCC1 mRNA对结直肠癌患者新辅助化疗效果的影响。

ERCC1基因位于人染色体19q13.32上，基因全长15 kBp，包含12个外显子，编码的蛋白质含有297个氨基酸[8]。ERCC1是人类DNA损伤修复基因，在核苷酸切除修复途径中起着关键作用[4, 9]。胃癌使用铂类药物化疗时，ERCC1 mRNA的表达水平与患者总生存期(OS)及化疗疗效相反[10]。Luo等[11]在分析中晚期胃癌患者ERCC1、胸苷酸合成酶等基因表达水平与化疗药物敏感性时发现，ERCC1 mRNA表达水平较低者铂类药物化疗疗效好。研究[12]发现，NSCLC患者使用铂类药物为基础的化疗方案时，ERCC1 mRNA低表达的患者疗效更佳。Joon等[13]研究奥沙利铂联合氟尿嘧啶治疗转移性结直肠癌患者ERCC1表达情况时发现，高表达的患者疗效更差且OS更短。本研究新辅助化疗方案为XELOX方案，有效率为57.14%，和目前国内同方案化疗疗效相当。本研究采用RT-qPCR方法检测42例结直肠癌患者术前ERCC1 mRNA的相对表达水平，其表达水平范围0.92～6.53，高于癌旁正常组织。提示ERCC1参与了结直肠癌的发生。本研究发现患者的ERCC1 mRNA表达水平与淋巴转移密切相关，表达水平较高的相对易出现淋巴转移，而与其他临床病理特征关系不密切，所以ERCC1 mRNA高表达的患者在淋巴清扫方面是否需要加强有待进一步研究。本研究结果显示有效组ERCC1 mRNA表达水平高于无效组。提示ERCC1与化疗疗效有关。ERCC1是核苷酸外切修复家族中的重要成员，主要参与损伤DNA链的切割与修复，ERCC1与DNA修复酶缺乏互补基因F(DNA-XPF)形成异源二聚体ERCC1-XPF，从而识别损伤并切除Pt-DNA加合物，然后在协同修复的作用下恢复基因的完整结构和化学性质，正常细胞ERCC1 mRNA高表达预示着DNA损伤后修复能力较强，不易形成肿瘤；而肿瘤细胞高表达则会对奥沙利铂等铂类药物导致的损伤进行更强修复从而产生耐药性，降低疗效。ERCC1 mRNA高表达的结直肠癌细胞修复能力更强，进入淋巴系统后更难被NK细胞等杀伤，更易出现淋巴结转移，本研究中淋巴结有转移患者新辅助化疗有效率为53.3%，低于淋巴结无转移患者的化疗有效率66.7%，但差异无统计学意义，可能与样本量较少有关，本研究为临床指导结直肠癌患者的个体化治疗提供了实验依据。

综上所述，ERCC1 mRNA可能是接受XELOX方案化疗的结直肠癌患者的疗效预测因子，ERCC1 mRNA高表达的患者从奥沙利铂等铂类抗肿瘤药获益的概率较低表达的患者低，从而指导临床提高化疗疗效并能减少化疗相关不良反应。局限于本研究入组患者数量有限，ERCC1 mRNA的表达水平在晚期结直肠癌中的预测作用有待于大规模临床试验进一步验证。