BMP-2/Smads信号通路在低剂量X射线促成骨细胞分化与矿化中的作用

王勤，吴波，张建华，李玉前，周晓中，王新峦

(1南通市第三人民医院，江苏南通226001；2苏州大学附属第二医院；3中科院深圳先进技术研究院转化医学中心)

射线应用于临床已有较长时间[1]，尤其骨折患者治疗前后都要受到X射线照射。中高剂量的X射线抑制骨髓细胞增殖分化同时,对骨髓细胞具有杀伤作用，可导致骨折延迟愈合甚至放射性骨坏死[2]。低剂量X射线有着完全不同的作用，我们前期通过构建大鼠股骨横行骨折模型，低剂量X射线能够促进骨折愈合过程中硬骨痂期骨痂矿化，从而促进骨折愈合[3]。骨折愈合过程包含复杂的重建与修复过程，骨痂形成对于骨重建起关键作用，而成骨细胞的分化和矿化对骨痂形成尤其重要。进一步研究显示,低剂量X射线上调成骨细胞相关因子(Runx2)与骨钙素(OCN)表达，进而促进成骨细胞分化与矿化[4]；而成骨细胞增殖、分化、凋亡及转型的过程涉及多条信号通路，骨形态蛋白2(BMP-2)/Smads信号通路是成骨细胞分化及细胞外基质合成、分泌所必需的[5]。2015年6月～2018年2月，本研究从BMP-2/Smads信号通路角度，探讨低剂量X射线促进成骨细胞分化和矿化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠UMR-106细胞(成骨细胞)(美国，ATCC)，CCK-8试剂盒(DOJINDO,日本)，ALP试剂盒(碧云天公司)，茜素红(美国，Sigma)，十六烷基吡啶(美国，Alpha公司)，ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)，SYBR@Green Realtime PCR Master Mix Reagent(TOYOBO公司), Anti-BMP-2抗体、Anti-Smads(1/5/4)抗体、Anti-Runx2抗体、Anti-Osterix 抗体(Abcam公司)，ELISA试剂盒(Uscn Life Science Inc)，NOGGIN(Peprotech公司)。医用直线加速器(美国，Siemens Primus公司)。

1.2 细胞培养、分组及处理 成骨细胞培养按照余墨声等[6]方法，随机分为照射组与对照组，培养48 h后，照射组给予单次0.1 Gy剂量X射线照射，对照组置于同样环境下不照射；另取成骨细胞分为0.1 Gy组、0.1 Gy拮抗剂组、control组及control拮抗剂组。0.1 Gy组、control组处理同上，两个拮抗剂组分别在0.1 Gy组及control组的基础上加入浓度为10 μg/mL的NOGGIN拮抗剂0.5 mg。

1.3 细胞增殖活性的检测 采用CCK-8法。用1×103/孔铺96孔板，培养48 h后，分别于照射后24、48、72 h，每孔加入培养基100 μL，CCK-8 10 μL，37 ℃孵育1 h，检测前每孔中加入1% w/v十二烷基磺酸钠终止液10 μL，多功能酶标仪检测450 nm吸光度值(A值)。

1.4 成骨细胞内ALP的检测 成骨细胞以1×104/孔铺48孔板，培养48 h后照射，照射后24、48、72 h提取总蛋白。用4 ℃ PBS冲洗3次，每孔加入蛋白裂解液100 μL ，并于冰上溶解20 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min后提取上清。稀释后取上清液50 μL与显色底物反应液50 μL反应，利用标准品p-nitro phenol(10 mmol/L)制作标椎曲线，在37 ℃中孵育5 min，每孔加入反应终止液100 μL，多功能酶标仪405 nm处检测样品OD值，再利用样品OD值在ALP标准曲线上读取酶的活性值(U/L)。

1.5 成骨细胞矿化的检测 成骨细胞以10×104个细胞每孔铺6孔板，培养48 h后照射，取照射后24、48和72 h后两组的成骨细胞，1%茜素红染色剂进行成骨细胞钙结节的染色并拍照，每孔加入10%十六烷基吡啶1 mL常温30 min后，将溶解液加入到96孔板，多功能酶标仪562 nm处检测A值。

1.6 成骨相关基因的检测 总RNA提取：以1×104个细胞每孔铺48孔板，培养48 h后照射，取照射24、48、72 h后两组的成骨细胞，每孔加入TRIzol 100 μL 裂解。RT-PCR：逆转录获得cDNA条件：65 ℃、5 min，冰水浴5 min，37 ℃、15 min，98 ℃、5 min。引物序列：BMP-2:上游引物5′- CCAGGTTAGTGACTCAGAACAC-3′，下游引物 5′-TCATCTTGGTGCAAAGACCTGC-3′；Smad1:上游引物5′-AAGGTGGGGAAAGTGAAAC-3′，下游引物 5′-CTGCTTGGAACCAAATGGGAA-3′;Smad5:上游引物5′-GGAACCTGAGCCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTTGCTGGGGAGTTGGGATA-3′;Smad4:上游引物5′-GTAGTAGGAGATGGAGCAC-3′，下游引物 5′-ATGCTTTAGTTCATTCTTGTG-3′;Runx2：上游引物5′-TAACGGTCTTCACAAATCCTC-3′，下游引物 5′-GGCGGTCAGAGAACAAACTA -3′;Osterix:上游引物5′-CAATGACTACCCACCCTTTCC-3′，下游引物5′- TGCCCACCACCTAACCAA -3′;OCN：上游引物5′-CACAGGGAGGTGTGTGAG-3′，下游引物5′-TGTGCCGTCCATACTTTC-3′;GAPDH：上游引物5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物5′- GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′)。cDNA稀释10倍后上300 ng的模板DNA；扩增体系20 μL：蒸馏水6.4 μL、SYBR®Green Realtime PCR Master Mix reagent 10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.8 μL、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL、cDNA模板2 μL，扩增步骤：预变性95 ℃、30 s；45个循环，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min。用2-ΔΔCT法行mRNA表达的CT值分析,以目的基因的相对表达量用于统计分析。

1.7 OCN蛋白的检测 采用ELISA法。成骨细胞以1×104/孔铺48孔板，培养48 h后，0.1 Gy组、control组及相应拮抗剂组进行相应处理，72 h后提取培养基4 ℃、12 000 r/min、10 min离心后取各组上清液。按照OCN试剂盒说明操作，利用酶标仪在450 nm波长下测定标准品吸光度(OD值)并制作标准曲线，再将样品测出各组吸光度，利用标准曲线计算出相应的浓度。

1.8 成骨相关蛋白的检测 采用Western blotting法。以10×104个细胞每孔铺6孔板，培养48 h后，0.1 Gy组、control组及相应拮抗剂组进行相应处理，72 h后取各组总蛋白，上样为50 μg，加入25%的上样缓冲液(Loading Buffer)后98 ℃变性10 min，10%聚丙酰胺凝胶电泳，湿法转膜，4 ℃ 5%牛奶过夜。含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)清洗3次后，加入1∶1 000稀释的小鼠抗大鼠抗体悬液，室温置于摇床上2 h，PBST清洗3次后，加入1∶5 000稀释的辣氧化根山羊抗小鼠的抗体液，室温置于摇床上2 h，PBST清洗3次后，加A+B混合发光液1 mL显影，用Image J软件对Western blotting条带进行灰度分析，测量出灰度值(ID)。

2 结果

2.1 两组细胞增殖活性比较 对照组照射后24、48、72 h成骨细胞A值分别为0.40±0.02、0.99±0.05、1.81±0.21，照射组分别为0.39±0.02、0.98±0.07、1.74±0.19，两组不同时间A值比较，P均>0.05。

2.2 两组ALP活性比较 对照组照射后24、48、72 h成骨细胞ALP分别为(2.439±0.096)、(4.750±0.050)、(3.306±0.531)U/L，照射组分别为(2.841±0.047)、(5.890±0.150)、(3.762±0.675)U/L。照射后24 h，两组ALP活性比较，P>0.05；照射后48、72 h，与对照组比较，照射组ALP活性升高(P<0.01或<0.05)。

2.3 两组骨矿化比较 照射后24、48 h，照射组与对照组比较矿化结节染色肉眼下无明显区别；照射后72 h，照射组矿化结节染色后肉眼下多于对照组。对照组照射后24、48、72 h成骨细胞的矿化A值分别为0.470±0.039、1.947±0.179、5.391±0.307，照射组分别为0.611±0.044、1.944±0.070、6.537±0.228；照射后24、48 h，照射组与对照组矿化A值比较，P>0.05；照射后72 h，照射组矿化A值高于对照组(P<0.01)。

2.4 各组成骨相关基因相对表达量比较 照射后24 h，照射组BMP-2、Smad1、Smad5、Smad4、Runx2、Osterix及OCN mRNA相对表达量与对照组比较，P均>0.05；照射后48 h，照射组各指标均高于对照组(P<0.05或<0.01)；照射后72 h，照射组Smad1 mRNA相对表达量高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.5 各组成骨相关蛋白相对表达量比较 照射后72 h，0.1 Gy组BMP-2、Smad1、Smad4、Smad5、Runx2、Osterix及OCN蛋白相对表达量高于control组(P均<0.05)；两个拮抗剂组各指标均下降，两组间各指标比较,P均>0.05。见表2。

3 讨论

细胞的生长倍增时间和生长曲线是反映细胞增殖活力的重要标志，通过准确地检测细胞倍增时间和观察细胞的生长曲线可以检测细胞的增殖能力[7]。在本研究中，照射后24、48、72 h，分别检测了照射组与对照组成骨细胞的A值，成骨细胞随着时间推移呈现倍数增长，表明细胞处于对数生长期，各个时间点相互比较A值差异无统计学意义，表明低剂量X射线对对数生长期成骨细胞的增殖无明显促进作用。

表1 各组成骨相关基因相对表达量比较

注：与对照组同时点比较，*P<0.05,**P<0.01。

表2 各组成骨相关蛋白相对表达量比较

ALP活性及矿化能力是成骨细胞不同阶段分化的重要标志[8]。ALP为成骨细胞早期分化并具有骨形成功能的重要生物学标志物[9]。本研究中，照射组与对照组在ALP活性和矿化量上比较均明显增加，照射后48 h,ALP活性达到高峰；照射后72 h，成骨细胞矿化达到高峰，与Luckey等[10]研究发现的低剂量X射线促进生物生长、发育及增强免疫的兴奋效应相一致；同时成骨细胞分化与矿化有时间先后顺序，表明低剂量X射线促进成骨细胞分化及矿化符合骨折愈合过程中骨痂矿化时间依赖性的生理过程。

在骨组织形成过程中，BMP-2通过自分泌与旁分泌作用，在细胞及细胞间质之间传导信息，调节成骨细胞的分化[11]。Welch等[12,13]发现,重组BMP-2蛋白在活体和离体实验中都能促进成骨细胞分化。本研究发现，照射后48 h，低剂量X射线促进成骨细胞BMP-2 mRNA的表达；照射后72 h，低剂量X射线增加成骨细胞BMP-2蛋白的分泌，提示低剂量X射线通过BMP-2促进成骨细胞分化有时间依赖效应，表明单次的低剂量X射线是通过激发成骨细胞自身的自分泌/旁分泌作用继而促进下游蛋白进一步表达发挥效应的。成骨细胞的分化涉及多条信号通路，其中BMP-2/Smads/Runx2/Osterix途径对成骨细胞分化及细胞外基质形成有非常重要作用。因此我们假设低剂量X射线可能是通过激活BMP-2/Smads信号通路调控下游成骨基因的表达进而发挥作用。本研究结果显示，在照射后48 h，低剂量X射线上调了Smad1/5/4、Runx2、Osterix和OCN mRNA的表达；照射后72 h，低剂量X射线上调了Smad1/5/4、Runx2、Osterix和OCN蛋白的表达，表明上述基因与蛋白的表达作用与BMP-2对成骨细胞分化与矿化的时间依赖作用相一致。BMP通过激活Smads信号传导，从而诱导Runx2基因表达[14]。Javed等[15]发现，Smads与Runx2相互作用可诱导成骨细胞分化，而Osterix是Runx2的靶基因，受到Runx2的转录调控[16]。由此为了证实单次低剂量X射线通过刺激成骨细胞分泌BMP-2蛋白，进而激活BMP-2/Smads信号途径发挥作用。我们应用NOGGIN拮抗剂，在照射后72 h，检测BMP-2、Smad1/5/4、Runx2、Osterix和OCN蛋白的表达与未加拮抗剂比较上述各指标表达均下降，其中0.1 Gy拮抗剂组与control拮抗剂组上述各指标表达差异无统计学意义。提示低剂量X射线可上调成骨细胞BMP-2蛋白表达，通过其自分泌/旁分泌方式激活细胞Smads信号通路，进而调控下游成骨基因的表达，从而促进成骨细胞分化与矿化。