血清微小RNA-155联合IL-35水平检测对脓毒症患者病情及预后的评估价值

张红玉，王佳，孙晓靖

(新疆医科大学第二附属医院，乌鲁木齐830000)

脓毒症是一种发病率和病死率较高的临床疾病，尽管发病机制尚未完全探明，但炎症反应过度导致炎症“瀑布”反应，致使形成全身炎症反应综合征，被认为是脓毒症发生发展的关键机制[1]。尽管治疗措施已有很大进步，但其病死率仍较高。目前脓毒症临床治疗原则为早期识别病情严重患者，及时予以干预，改善预后，降低病死率[2]。临床常用的降钙素原(PCT)、白细胞介素-6(IL-6)、急性生理学与慢性健康状况评分系统(APACHEⅡ)等指标，对于评估脓毒症患者病情及预后的临床价值较差，因此临床研究找寻能早期诊断、准确判断脓毒症病情及预后的最佳指标至关重要[3]。近年，微小RNA-155(miRNA-155)及IL-35引起临床高度关注，其中IL-35参与感染及炎症等多种疾病发生发展，而miRNA-155通过调控多条重要炎症信号通路发挥促炎效应，因此miRNA-155及IL-35被认为是具有较好潜在价值的新型血清标记物[4]。目前尚未见脓毒症患者血清miRNA-155及IL-35水平动态变化以及其对病情及预后评估价值的报道，本研究对此进行了相关探讨，为临床进一步探讨改善脓毒症预后提供循证依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年6月～2017年12月在新疆医科大学第二附属医院ICU住院治疗的危重病患者82例，其中男44例、女38例，年龄(54.6±8.3)岁，体质量指数(18.1±1.4)kg/m2，既往糖尿病史23例、高血压史37例。脓毒症患者40例(观察组)、无脓毒症患者42例(对照组)。纳入标准：①脓毒症诊断标准符合美国重症监护医学学会(SCCM)及欧洲重症医学会(ESICM)(2003年)联合确定的脓毒症诊断标准[5]；②年龄18～70岁；③能坚持随访，临床资料完善。排除标准：①病情危重，不能确定14 d生存状况；②脑、肺、肝、肾等严重脏器功能不全；③严重糖尿病并发症或肿瘤晚期；④研究期内自行放弃治疗及临床资料不完整者。两组年龄、性别、体质量指数以及既往内科疾病史等有可比性。

1.2 治疗方法 观察组参照SCCM及ESICM联合确定的脓毒症诊疗指南，主要依据血培养或分泌物培养或涂片结果进行有效抗感染治疗、治疗原发疾病，纠正水电解质酸碱平衡、加强营养支持对症等处理。对照组治疗原则为维系生命体征稳定、治疗原发疾病以及营养支持对症处理。

1.3 血清IL-35、PCT以及IL-6水平检测 分别于治疗第1、7、14天，两组均于清晨空腹采集肘静脉血3 mL，2 000 r/min离心10 min，分离所得血清置于-80 ℃冰箱备检。采用ELISA法检测血清IL-35、PCT以及IL-6水平。IL-35、PCT以及IL-6测定试剂盒购自美国BD公司，各标记物检测操作严格按试剂盒说明书进行。

1.4 健康状况评价 两组分别于治疗第1、7、14天均进行APACHEⅡ评分，主要为急性生理评分(APS)、年龄及慢性生理评分(GPS)三部分组成，其中APS为12项参数，每项分值为0～4分，总分值0～60分；年龄分值0～6分；CPS 2～5分，总APACHEⅡ评分值0～71分。

1.5 血清miRNA-155的检测 分别于治疗第1、7、14天，采用实时荧光定量PCR法。采用miRNA检测试剂盒(购自美国Life Technology公司)将所得miRNA逆转录成cDNA链，具体操作以及反应体系和条件依据厂家说明书确定。内参为小核RNA U6(snRNA U6)，其上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miRNA-155上游引物：5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG-3′，下游引物：5′-GCAGGGTCCGAGG-3′。反应条件为：预变性95 ℃、5 min；95 ℃、10 s变性，60 ℃、20 s退火，72 ℃、20 s延伸，40个循环。以2-ΔΔCt表示观察组miRNA-155相对于对照组的表达水平，ΔCt=Ct目标-Ct内参。

1.6 随访 随访3个月，随访间隔1个月，记录患者的死亡例数。根据患者预后结局分为生存组54例、死亡组28例。

2 结果

2.1 两组不同时间血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHE Ⅱ评分比较 见表1。对照组不同时间血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHE Ⅱ评分比较，P均>0.05。观察组miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHE Ⅱ评分随治疗时间延长而逐渐降低(P均<0.05)，但同一时间点观察组各指标均大于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 两组不同时间血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHEⅡ评分比较

2.2 相关性分析 Pearson相关分析显示，脓毒症患者血清miRNA-155与血清PCT、IL-6及APACHEⅡ评分呈正相关(r分别为0.818、0.725、0.571，P均<0.05)，血清IL-35与上述各指标呈正相关(r分别为0.865、0.858、0.564，P均<0.05)。

2.3 生存组与死亡组血清miRNA-155与IL-35比较 生存组血清miRNA-155水平为2.92±0.91，死亡组为5.85±1.07，两组比较，t=3.210，P=0.018；生存组血清IL-35水平为(459.7±39.5) pg/mL，死亡组为(768.1±43.2) pg/mL，两组比较，t=3.115，P=0.023。

2.4 预后影响因素 以随访3个月生存率为应变量，年龄、血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHEⅡ评分为自变量，应用全模型多元Logistic回归分析方法进行回归分析，结果显示血清miRNA-155、IL-35及PCT为脓毒症患者预后的危险因素(表2)。

表2 临床指标多元Logistic回归分析结果

2.5 血清miRNA-155与IL-35检测对预后的评估价值 血清miRNA-155截断值为3.50，预测脓毒症患者随访3个月预后不良发生的曲线下面积(AUC)为0.796，P为0.041，灵敏度78.6%，特异度89.3%；血清IL-35截断值为560 pg/mL，预测随访3个月预后不良发生的AUC为0.816，P为0.039，灵敏度77.9%，特异度90.1%；两者联合检测预测脓毒症患者随访3个月预后不良发生的AUC为0.853，P为0.031，灵敏度86.2%，特异度88.3%(见图1)。

图1 治疗前血清miRNA-155与IL-35水平检测预测脓毒症患者预后的ROC曲线

3 讨论

脓毒症的发病机制极为复杂，目前公认全身炎症网络效应是其中重要因素之一，由于感染等多种诱因导致机体免疫失衡，被炎症网络进行级联放大，最终导致全身炎症反应综合征[1,2]。脓毒症早期较为隐匿，出现明显临床症状后即便予以完善全面临床治疗措施，预后仍较差，病死率可达70%，因此加强对脓毒症的早期预测评估，及时发现高危患者并给予干预，能进一步阻断病情发展，改善患者预后[6,7]。

近年研究显示，miRNA在维持机体自身稳态、参与炎性疾病病理生理过程等方面具有重要效应，其中miRNA-155是研究热点，被认为是脓毒症炎症网络效应的平衡点参与病理生理发生发展过程，可作为早期诊断脓毒症的敏感指标，也可能是今后脓毒症患者接受免疫调理以及基因治疗的重要靶点[8～10]。国外脓毒症实验动物模型研究证实，miRNA-155在体内免疫应答调控过程中具有重要作用，主要是通过上调TNF-α水平，调节辅助性T细胞(Treg)的增殖以及T细胞亚群比例，促进炎症反应，从而对整个免疫网络进行调节[11,12]。研究显示，体内miRNA-155表达水平与脓毒症患者免疫失衡程度存在相关性，增加脓毒症患者的病死率，对脓毒症的病情严重程度也有一定预警作用[13]。

IL-35是新发现的具有较好潜在治疗前景的抗炎因子，其参与多种炎症疾病的免疫调节，主要是通过促进IL-10分泌，抑制IL-17以及IFN-γ的产生，从而有效抑制特异性免疫应答，减轻机体炎症反应水平[14，15]。近年研究也发现，IL-35能有效地改善感染性疾病，延缓其本身导致的免疫炎症反应的发展，并且IL-35能通过上调诱导型Treg以增强机体对感染所致炎性反应的耐受性，因此被认为可作为脓毒症诊断的血清标志物[16,17]。

近年研究显示，miRNA-155可能通过调控IL-35发挥免疫炎症调控效应[18]。进一步研究发现，miRNA-155与IL-35存在相互调节、相互影响，共同参与脓毒症炎性反应病理生理过程，因此临床研究者推测通过动态检测miRNA-155与IL-35，能有效对脓毒症患者的诊断、病情严重程度以及预后进行评估，但目前尚未见临床报道予以证实[4]。故为进一步了解脓毒症患者血清miRNA-155与IL-35水平动态变化情况，以及与患者病情及短期预后结局的相关性，本研究通过分析我院ICU收治的脓毒症患者临床资料，以此为临床更好治疗脓毒症提供循证依据。

本研究结果显示，两组年龄、性别、BMI及既往内科病史等一般观察指标差异无统计学意义，提示本研究系统误差控制较好。在任意同一时间点观察组血清miRNA-155、IL-35、PCT、IL-6及APACHEⅡ评分均高于对照组，表明在危重患者中miRNA-155与IL-35能有效鉴别脓毒症，而随着治疗进行上述指标呈进行性降低，提示血清miRNA-155与IL-35与病情程度可能存在正相关，其动态变化能提示脓毒症的发展过程，对于治疗方案修订具有较好的临床价值。进一步分析显示，血清miRNA-155与IL-35水平与血清PCT、IL-6及APACHEⅡ评分均呈正相关，而PCT、IL-6及APACHEⅡ评分均是临床常用的评估脓毒症病情指标，因此认为，血清miRNA-155与IL-35水平能有效评估脓毒症患者的病情。同时本研究显示，对照组各项指标无显著性变化，提示血清miRNA-155与IL-35指标对于非脓毒症患者没有特异性。本研究进行为期3个月的短期随访，分析显示生存患者血清miRNA-155与IL-35水平低于死亡患者，提示血清miRNA-155与IL-35能够预测脓毒症患者的短期预后。Logistic回归分析结果显示，血清miRNA-155与IL-35为脓毒症的危险因素，提示对脓毒症患者动态监测血清miRNA-155与IL-35能对预后，尤其是生存情况进行有效评估。应用ROC曲线评估治疗前血清miRNA-155与IL-35水平预测脓毒症患者的短期预后不良的临床价值较佳，并且敏感度和特异度也较好。然而本研究的样本量较少，研究结论仍需要大样本多中心的临床研究进一步证实。同时miRNA-155与IL-35在体内进行相互调节的具体分子机制仍需进一步探讨。