恩替卡韦、干扰素治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者肝组织内HBV cccDNA变化差异及相关性分析

庄立伟，赵莹莹，全 敏，李 玥，李 贲，王笑梅，欧蔚妮，邢卉春

首都医科大学附属北京地坛医院肝三科，北京 100015

全球约2.4亿人HBV慢性感染[1-2]，感染慢性化，是由于被感染肝细胞核内HBV cccDNA的持续存在[3-7]。HBV感染经临床治愈后，仍然有低水平的cccDNA存在，HBsAg阴转后，仍可以发生病毒复发[8-9]。cccDNA在肝细胞核中数量比较稳定，称为cccDNA池[10-11]。cccDNA池的存在可能发挥以下作用：(1)持续作为病毒复制模板；(2)cccDNA的非半保留复制机制，使抗病毒治疗效果受到影响；(3)停止抗病毒治疗后易复发，病情反复。抑制或根除cccDNA可以获得显著的临床效果，如病情进展得到控制、HCC发病率降低[12-14]，血清学阴转后HCC相关肝脏部分切除术或肝移植术后HBV复发率降低[15-17]。因此，我们通过定量检测HBV cccDNA及相关指标的变化，分析恩替卡韦、干扰素对肝组织内HBV cccDNA含量及HBV复制能力的影响，同时分析HBV cccDNA变化与血清生化学、病毒学指标之间的相关性。

1 资料与方法

1.1病例选择从慢性乙型肝炎抗病毒治疗研究中选择HBeAg阳性且治疗前后均行肝穿刺活检检查的病例40例。其中接受恩替卡韦治疗者24例：口服恩替卡韦0.5 g，1次/d，共24周；接受干扰素治疗者16例：α2b-干扰素500万单位肌注，隔日1次，共24周。

1.2数据及标本收集收集所有病例人口统计学数据、生化学指标、病毒学指标，以及治疗前后肝穿组织蜡块。

1.3HBVcccDNA定量检测肝组织DNA用QIAgen公司生产的DNA提取试剂盒提取。HBV cccDNA采用实时定量PCR方法[18]，实现HBV cccDNA的特异性扩增。

2 结果

2.1患者人口统计学数据分析恩替卡韦组和干扰素组性别、年龄、病程、体质量相比，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(见表1)。

表1 人口统计学数据分析 Tab 1 Analysis of demographic data

2.2两治疗组肝组织内HBVcccDNA、总HBVDNA及血清总HBVDNA含量两治疗组肝组织内HBV cccDNA基线值比较，差异无统计学意义(P=0.050)；治疗后两组HBV cccDNA值差异有统计学意义(P=0.004)，恩替卡韦组明显优于干扰素组。两治疗组肝组织内HBV DNA(log10拷贝/ml)基线值比较，差异无统计学意义(P=0.134)，治疗后两组比较差异有统计学意义(P=0.003)，恩替卡韦组明显优于干扰素组。血清总HBV DNA(log10拷贝/ml)基线值比较，差异无统计学意义(P=0.929)，治疗后两组比较差异有统计学意义(P=0.002)，恩替卡韦组明显优于干扰素组。两组肝组织内HBV cccDNA、肝组织总HBV DNA、血清总HBV DNA治疗前后比较差异均有统计学意义(P均<0.05)(见表2)。

表2 肝组织内HBV cccDNA、总HBV DNA及血清总HBV DNA含量 Tab 2 The content of HBV cccDNA in liver tissues, total HBV DNA and HBV DNA in serum log10 copies/ml

2.3肝组织内HBVcccDNA下降百分率与治疗后HBeAg之间的相关性分析DNA下降百分率(%)=(基线DNA值-治疗后DNA值)/基线DNA值×100%。对肝组织内HBV cccDNA下降百分率与治疗前后ALT、AST、TBIL、DBIL、TP、HBsAg、HBeAg进行相关性分析显示，肝组织内HBV cccDNA下降百分率与治疗后HBeAg有显著相关性(R2=0.183，P<0.05)(见图1)。

图1 肝组织内HBV cccDNA下降百分率与治疗后HBeAg的相关性分析Fig 1 Correlation analysis between the decreased ratio of HBV cccDNA in liver tissues and post-treatment HBeAg

2.4HBV复制指数分析HBV复制指数=血清总HBV DNA(log10拷贝/ml)/肝组织内HBV cccDNA(log10拷贝/ml)。两治疗组基线HBV复制指数差异无统计学意义(P=0.171)，两组治疗后较治疗前均有所下降，恩替卡韦组优于干扰素组，但两组比较，差异无统计学意义(P=0.210)(见表3。)。

表3 HBV复制指数分析Tab 3 Analysis of the replication index of HBV

3 讨论

一般认为，慢性乙肝患者在HBsAg血清转换、血清HBV DNA阴转、肝功恢复正常之后，即表明患者在生化学及组织学意义上的肝脏炎症就已消除。但WERLE-LAPOSTOLLE等[19]定量检测22例阿德福韦酯治疗的慢性乙肝患者肝组织HBV cccDNA，发现治疗48周后，发生HBsAg清除及HBeAg阴转的患者肝组织仍检测到HBV cccDNA。SUNG等[20]随访观察了47例拉米夫定单一或联合聚乙二醇干扰素治疗1年的HBeAg阳性慢性乙肝患者，在治疗结束时及结束后52周测定血清HBV DNA及肝组织HBV cccDNA，29例在治疗结束时有病毒学应答，其中15例在治疗结束后52周仍有持续应答反应，但患者肝组织中均存在HBV cccDNA。提示此类患者肝脏中仍然存在低水平的乙肝病毒复制，在化疗或免疫抑制剂使用的情况下，乙肝病毒可能重新复制活跃。因此，减少肝细胞内HBV cccDNA的含量或抑制病毒复制能力，是治愈HBV慢性感染的关键。

本研究数据显示，HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者治疗后肝细胞内HBV cccDNA在恩替卡韦组与干扰素组比较，差异有统计学意义，恩替卡韦组明显优于干扰素组。血清总HBV DNA、肝组织内总HBV DNA数据分析结果也如此。提示恩替卡韦、干扰素均能有效降低肝组织内HBV cccDNA、血清总HBV DNA含量、肝组织总HBV DNA，恩替卡韦优于干扰素。

对肝内cccDNA下降百分率与治疗前后病毒学、生化学指标进行相关性分析，发现肝组织内HBV cccDNA下降百分率与治疗后HBeAg有显著相关性(R2=0.183)，治疗后HBeAg越少，HBV cccDNA下降幅度越大。这提示，对于HBeAg仍阳性的患者，可以通过监测HBeAg变化，了解肝组织内HBV cccDNA含量，了解抗病毒治疗的应答情况。

HBV复制指数反映HBV以cccDNA为模板复制为各种病毒DNA的活动程度。HBV cccDNA活性可能受到表观遗传调控的影响，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化等[21-23]。DNA复制指数能够反映病毒的复制能力，HBeAg阳性患者数值较高，提示病毒复制活跃。不同的免疫状态，也会影响复制指数[24-25]。非活动性HBeAg阳性慢性乙肝患者cccDNA水平及病毒复制指数低于活动性HBeAg阳性慢乙肝患者[26-27]。本研究显示，治疗前恩替卡韦组HBV复制指数组内对比，恩替卡韦组治疗后显著低于治疗前，差异有统计学意义，干扰素组治疗前后相比，差异无统计学意义，这说明恩替卡韦可以有效抑制病毒复制，而α-干扰素则未观察到。这与GUO等[21]发现在细胞分裂期，α-干扰素不能有效加快HBV cccDNA丢失一致。两治疗组比较，差异无统计学意义，这可能与样本量小有关。分析结果提示，恩替卡韦直接抑制病毒复制，而干扰素直接抑制病毒能力弱，可能其主要通过免疫调节来清除病毒。

研究表明，HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者，恩替卡韦和干扰素治疗均能降低肝组织内HBV cccDNA含量，恩替卡韦治疗效果更好。对HBV复制指数的影响，两者比较，差异无统计学意义。肝内HBV cccDNA下降百分率与治疗后HBeAg有显著相关性，提示临床上对于HBeAg阳性的患者可以通过监测其含量了解肝内cccDNA的变化。