人胃癌双标细胞系及鼠原位模型的高效构建

胡 皓， 王 敏， 吴开春

1.复旦大学附属中山医院内镜中心，上海 200032； 2.第四军医大学西京消化病医院

胃癌是常见的消化系统肿瘤，是第二大致死性肿瘤，5年生存率仅20%～30%[1-2]，仅次于肺癌。因此，胃癌的研究受到越来越多的重视。动物模型作为肿瘤机制及治疗研究的重要方法，在癌症研究中具有重要地位,特别是肿瘤原位模型,因其更加贴近和模拟肿瘤原始生长环境，相较其他模型具有独特研究优势和更广阔的应用范围[3-4]。然而，由于胃是空腔脏器，又深植于组织内部，构造原位模型相对困难。以往报道的原位模型建立方法存在动物死亡率高、操作时间长、成瘤率低等问题。本研究建立了一套简便的小鼠胃癌原位模型构建方法。该方法可短时间内高效制备胃癌原位模型，可为胃癌研究提供研究便利。

1 材料与方法

1.1实验细胞、动物、试剂及仪器胃腺癌细胞系SGC-7901，慢病毒包装细胞HEK-293T由肿瘤生物学国家重点实验室保存。6～7周龄雌性BALB/C小鼠购自北京维通利华[SCXK(京)2011-0011]，饲养于第四军医大学实验动物中心[SYXK(军)2007-020]。慢病毒构建载体pWPT-GFP、pMD2.G、psPAX2、pLenti-CMV-Puro-LUC、Delta 8.9、VSVG购自Addgene公司。DMEM及质量浓度为100 g/L的胎牛血清购自Hyclone公司。Lipofectamin 2000购自Invitrogen公司。Polybrene购自Millipore公司。Puromycin购自Sigma公司。D-luciferin购自Caliper公司。体视显微镜购自Olympus公司。小动物成像仪为IVIS Kinetic小动物成像系统。

1.2慢病毒包装4×106293T于转染前1 d铺于10 cm平板，使用Lipofectamin 2000转染质粒pLenti-CMV-Puro-LUC、Delta 8.9及VSVG。转染后48 h收集细胞上清，保存于-80 ℃。感染SGC-7901前1 d将细胞铺于6孔板，每孔细胞数量为5×105。将病毒上清与Polybrene(8 μg/ml)混合后加入细胞培养液，将培养板在32 ℃条件下1 200×g离心90 min，提高感染率。48 h后加入带有Puromycin筛选培养2周。将筛选出的阳性克隆再次感染GFP病毒。GFP病毒的包装质粒为 pWPT-GFP、pMD2.G、psPAX2。感染及包装过程同前。GFP感染后行流式细胞分选，选出阳性克隆。至此构建双标细胞系SGC-7901/FLUC/GFP。

1.3体外检测SGC-7901/FLUC/GFP活性倍比稀释法将SGC-7901/FLUC/GFP铺于96孔板。培养液补足100 μl每孔。首先选取GFP滤光片组，行IVIS荧光成像。荧光成像后，移液器每孔加入3 μl 浓度为150 μg/ml的D-luciferin，行生物发光模式采集。采集信号强度使用Living Image软件分析。

1.4原位模型建立8只6～7周龄小鼠使用异氟烷气体麻醉后，与左正中旁线切开约0.5 cm的小切口，无齿顿头镊小心从腹腔内取出胃。无菌纱布周围保护。在体视显微镜下，选取胃体大弯侧30 G注射器小角度进针，缓慢推入含有5×105个SGC-7901/FLUC/GFP的细胞悬液约30 μl。棉签轻压注射口，防止溢出后，还纳胃入腹腔(见图1)。依序缝合腹膜及皮肤。术后皮肤碘伏消毒。小鼠给予含有复方去疼片的饮水3 d。饮水需每天更换以防变质。

图1快速原位模型构建方法A：暴露胃；B：注射细胞；C：缝合

Fig1ProceduresoforthotopicgastricmodelA: exposure of stomach; B: injecting tumor cells; C: suture

1.5原位模型活体成像观察造模小鼠3 d后给予D-luciferin 150 μg/ml。10 min运动后麻醉，置于IVIS成像暗室行生物发光成像。成像采集时间1 min。

1.6胃癌原位移植瘤的鉴定造模小鼠2周后，处死小鼠行冰冻切片及HE染色观察造模情况，并拍照。

2 结果

2.1成功构建胃癌双标细胞系SGC-7901/FLUC/GFP胃癌细胞SGC-7901经2次慢病毒感染及筛选、流式分选后，得到了高表达荧光素酶Luciferase及绿色荧光蛋白GFP的双标细胞。通过生物发光实验及荧光显微镜观察，SGC-7901/FLUC/GFP可满足后续在体观察和分析的需要。MTT实验证明与亲本细胞生长无异(见图2)。

2.2SGC-7901/FLUC/GFP生物活性分析倍比稀释法将SGC-7901/FLUC/GFP铺于96孔板，放入IVIS成像系统后，行荧光成像和生物发光成像。成像结果与定量分析表明，荧光信号和生物发光信号强度与细胞数目呈线性正相关(R2=0.9667，r2=0.9110)。结果提示，生物发光及荧光信号强度可作为提示肿瘤细胞数量的标志(见图3)。

图2胃癌双标细胞系SGC-7901/FLUC/GFP的构建A：荧光显微镜观察(100×)；B：生物发光图像；C：MTT实验

Fig2Establishmentofdouble-labeledgastriccancercelllineSGC-7901/FLUC/GFPA: fluorescent microscopy (100×);B: bioluminescence imaging； C: MTT assay

2.3小鼠原位模型构建及监测小鼠原位胃癌模型构建后，第3天采用生物发光成像观察体内肿瘤生长情况。8只小鼠均可见生物发光信号，成瘤率100%(见图4)。生物信号未提示腹腔内种植。生物发光信号可用于长时间活体观测肿瘤生长情况。通过定量分析可大致判断体内肿瘤载量。

2.4胃癌原位模型的组织学分析2周后处死造模小鼠，观察造模情况。肿瘤呈现外生性生长表现。HE染色和冰冻切片结果显示，肿瘤生长状态良好，癌细胞呈巢样生长，细胞形态一致,核深染(见图5)。

3 讨论

早在1969年,RYGAARD等[5]就首次成功创建了人类肿瘤裸鼠皮下移植模型。然而随着人们研究的深入，发现皮下移植瘤脱离了肿瘤生长的原发部位，并不能真实模拟肿瘤在原位的生物学行为和特点。而采用原位建模的方式则尽可能贴近肿瘤原发部位的环境[6]。

图3 SGC-7901/FLUC/GFP成像分析 A～B：生物发光成像及其线性分析；C～D：荧光成像及其线性分析Fig 3 Imaging evaluation of SGC-7901/FLUC/GFP A-B: bioluminescence imaging and its linear analysis; C-D: fluorescent imaging and its linear analysis

图4 原位胃癌模型生物发光检测Fig 4 Bioluminescence imaging of orthotopic gastric cancer

在胃癌原位模型的移植方法中，FURUKAWA等[7-8]报道的挂线法是将新鲜的肿瘤组织块直接缝挂在浆膜层损伤的胃壁上。在此基础上，近年又发展出荷包缝合法、OB胶、三维组织移植法等[9-12]。挂线法一方面需要将浆膜划开，造成鼠胃不必要损伤、出血。另一方面，缝合不善易导致瘤组织脱落入腹腔，造成腹腔种植，降低成瘤率[9]。而荷包法因为需要较为复杂的手术技术，因而操作时间较长，不易掌握。无论是挂线法、荷包法，还是OB法，均是肿瘤组织在浆膜外生长，与肿瘤真实情况不同。而本研究报道的悬液注射法，操作方法简单，建模时间短，同时克服了以往报道[8,13]成瘤率低的问题。

图5 胃癌原位实体瘤组织分析 A：原位肿瘤生长情况；B：离体胃；C：HE染色分析(40×)；D：冰冻切片观察GFP+肿瘤生长(40×)Fig 5 Histological analysis of orthotopic gastric cancer A: anatomical view of the gastric cancer; A: location of the tumor on stomach; B: HE stain (40×); C: frozen section showed GFP+tumor (40×)

小动物成像技术是采用分子成像技术对各种生物学变化进行定量、定性分析的新方法。小动物活体成像技术可以获得动态、直观图像，同时非侵入性方法极大地节约了实验动物[14]。本实验采取的生物发光技术因其可以实现深部组织成像，可以非常方便地用于评价原位肿瘤建模是否成功，以及观测肿瘤生长状态[15-16]。我们前期研究[6]结果发现，在原位移植模型构建当天即可行生物发光成像用以判断是否构建成功。对于无生物发光标记的其他胃癌细胞系，如BGC-823、MKN-28等，我们用上述方法同样可以构建成功。提示本方法具有良好的稳定性和可重复性。

实验方案中也可采用静脉麻醉，如常用的水合氯醛、戊巴比妥钠、氯胺酮等。使用液体法的好处是造模中可防止长时间气体麻醉剂对手术人员造成的潜在损伤。但液体麻醉剂量应严格控制，避免麻醉过量造成小鼠死亡。手术过程中及术后可使用保温装置，防止小鼠低体温死亡及提高苏醒率。此外，在注射瘤细胞过程中应缓慢进针，进针深度不易过深，如误将瘤细胞注射入胃腔则会导致造模失败。造模过程中应尽量防止细胞悬液外溢进入腹腔，避免潜在腹腔种植[17]。

本研究所报道的胃癌原位模型构建方法有以下特点：(1)操作步骤简单，无复杂的手术操作步骤，不需要特别的仪器设备，便于广大研究人员借鉴和掌握；(2)成瘤率高，成瘤率近100%；(3)建模时间短，适合大量、高效制备胃癌原位模型。因此，本方法是肿瘤机制研究及抗肿瘤药物筛选的良好平台及载体。