哺乳动物初乳中的乳铁蛋白的抗菌机理研究

◎ 杨晓惠

（汤臣倍健股份有限公司，广东 珠海 519040）

初生哺乳动物的自身免疫防御系统不成熟，难以有效防御细菌。为使幼体补充必要的免疫物质，对哺乳动物初乳中的乳铁蛋白的摄入异常关键。乳铁蛋白，简称LF（Lactoferrin），是分布于初乳中典型活性单体糖蛋白，可发挥抗病原微生物的作用，广谱抗菌能力突出。包括人类在内，哺乳动物初乳中的LF比后期常乳中含量多出十多倍。高浓度的蛋白表达下，LF的抗菌活性因其酶解后产生肽段而增强，它们的抗菌优势并非一般抗生素可比拟，对细菌类、病毒、真菌等有广谱抗性，且无生物毒性，不存在外源性化学成分。由于LF酶解肽的抗菌模式不定，降低了受作用病原微生物的耐药性[1]。

1 LF概述

1.1 LF物质结构特性

LF，分子量近80 kDa，是一种铁结合类单体糖蛋白，形成年限超1.25亿年，与转铁蛋白系同源物质，同属转铁蛋白家族。其结构组成上，由对称形式的N-叶和C-叶组成[2]。

对称两叶具有同源性，单叶可细分结构域。单体N-叶和C-叶均可独立结合三价铁离子，与铁元素结合位置将出现4个氨基酸残基。LF的表位电荷分布多为正电荷，因而遇到大量携带负电荷的细胞膜后可快速结合[3]。

LF常常会在无铁（apo-LF）与铁饱和（holo-LF）状态中转换，多数细胞的apo-LF将被排出细胞外，而若结合过量Fe3+则会变成holo-LF留在细胞内。在人类的LF研究中，为消除水解酶作用并减少受体识别概率，LF可增加诸如磷酸化、N-聚糖等多元修饰位点。

1.2 LF物质功能特性

LF蛋白在哺乳动物体内的分布较为广泛，多见于外分泌液（乳汁、唾液、泪液、鼻分泌物），且在血浆、羊水、胆汁、子宫分泌物、尿液以及中性粒细胞中也含量较多，相比较而言，属初乳中含量最高。研究指出，LF可有效调节体内铁平衡、参与骨髓细胞形成、激励细胞生长、促进机体免疫、增强抗病性及抗高血压性[2]。LF作为新型抗菌类生物药物，可有效协同抗生素及抗真菌制剂作用于哺乳动物产生更多病理性作用。

1.3 LF物质抗菌方式

①铁剥夺是基本抑菌机制。主要是对哺乳动物体内存在的apo-LF或不饱和LF而言，它们对铁元素的结合性与掠夺性极强，主要在体内参与细菌、真菌、病毒等病原性微生物的铁元素竞争，大量结合铁离子导致病原性微生物必要的铁元素得不到补给从而死亡。当然，在LF大量结合铁离子的过程中，部分微生物难以脱离铁元素而生成致病性生物膜，整体上的降菌效果显著。②膜渗透的基本作用机制原理在于通过电荷吸引来破坏细胞膜从而杀死病原菌，如对革兰氏菌群而言，LF自带正电荷，与革兰氏阳性菌磷壁酸或革兰氏阴性菌脂多糖之间形成电荷吸引，直接击破细胞膜，破坏生理功能，提升通透性，同时使得脂多糖渗出，大量物质流失导致病原菌被杀死。③酶抑制主要突出LF的酶体活性降解，从而有效减少各种细菌毒力因子或黏附蛋白，这样可有效降低病原体与LF的有机结合，降低对哺乳动物细胞的不良侵入与影响。通常在LF表位携带有大量的正电荷，此电荷具有碱性、高密度特征，这样就将直接与部分细菌或宿主细胞的生物分子结构相结合，因而产生更加明确的非特异性[3]。

2 LF与病原微生物细胞膜的结合能力

2.1 LF与细胞膜脂质

在牙周炎的相关研究中发现，引发牙周炎的主要病菌为牙龈卟啉单胞菌和普雷沃菌，LF与酶解抗菌多肽都能抑制两种病菌的生长，而LF将结合病菌细胞膜上的脂质作用来完成抑制效果。

2.2 LF与细胞膜脂多糖

沙门氏菌与大肠杆菌等革兰氏阴性菌细胞外膜含大量脂多糖物质，在与LF结合作用后，可解除细胞膜上的脂多糖。据研究，LF与脂多糖的结合得益于表位酶解肽段的作用，利用静电作用等技术加强酶解多肽体与脂多糖的结合，可有效缓解脂多糖对哺乳动物机体刺激性。

2.3 LF与细胞膜蛋白

LF可利用细菌细胞膜表的结合蛋白促成与膜的结合。研究表明，若假单胞菌细胞表面的LF结合蛋白再次与LF集合，则可有效发挥阻碍生长的效果。对溶血性曼氏杆菌而言，LF发挥的抗菌杀菌作用机理在于其可结合菌体的外膜蛋白与孔蛋白。

3 LF的酶解多肽抗菌能力

3.1 Lfcin的抗菌机理研究

Lfcin是LF于胃部酸性环境的酶解作用下，由N端释放的氨基酸残基肽体，编号17-41段，自身无法结合铁离子，囊括LF的所有生物学活性。Lfcin在LF结构中可于表面构建α-螺旋的二级结构，如图1[4]所示。

图1 Lfcin（17-41）与Lfampin（268-284）在LF中的位置分布图

一旦在液相环境下，因水溶剂影响发生变构作用，将呈现两个反相平行的β-折叠结构，如图2[5]所示。特殊的α-螺旋二级结构增加了胞膜脂质的亲和力，可为LF的细胞膜结合提供必要的正向效果保障。

图2 Lfcin抗菌肽的二级结构和表面电荷分布图

Lfcin的抗菌杀菌作用机理，主要是依靠自身正电荷，与LF的膜渗透方式产生机制相类似，会与有关细胞壁酸质或脂多糖发生静电吸引作用，从而增加附着力，借助必要的疏水架构在细胞膜中完成脂质分子层的变构，开辟传输路径后确保抗菌肽体可进入细胞中，或引发更多细胞膜的孔洞形成，使得细胞内部物质大量流失，从而实现灭菌效果。相关作用机理可利用荧光信号分子实验来观察分析流向，准确反馈不同细菌的细胞膜破裂灭亡情况。

3.2 Lfampin的抗菌机理研究

Lfampin来自于LF酶解肽段中的268-284部位氨基酸，可形成N端两亲性α- 螺旋结构，且C端的正电荷对抗菌作用的能力贡献突出。

Lfampin与细菌胞膜的结合，主要是C端正电荷先行吸引细菌的蛋白外膜，然后由N端螺旋结构深度结合，显然通过增加C端的正电荷物质数可提升抗菌活性。在有效实验中，采用人为干预的方式增加Lfampin的改造可增加抗菌肽的抗菌能力，如可串联改造Lfampin与Lfcin肽段，合成物能够发挥更强的细胞膜结合能力与抗菌活性。

3.3 LF的其他抗菌肽段抗菌机理研究

在人类LF的提取合成抗菌肽中，HLR1r能够产生明显的革兰氏菌群抗性。对多肽LF11而言，自身对细胞膜的破坏功效是显而易见。此外，利用清除非带电荷残基、补增肽体N端疏水氨基酸或增加N端酰化作用，都能够增加多肽LF11的抗菌能力。而多肽L10对于耐药性强的真菌杀伤效果显著，主动结合细菌脂质与脂多糖，增强胞膜的通透性，从而有效灭杀细菌。经过研究，不少源自LF单倍的抗菌多肽都可发挥明显的抑制真菌的作用。LF蛋白衍生多肽HLopt2和HLBD1可杀伤假丝酵母，特别是HLopt2能够促使酵母菌细胞膜表出现大量凹陷或坑洞，增加对细胞膜的结构破坏力，发挥杀菌作用。

4 结语

通过对哺乳动物初乳中的乳铁蛋白抗菌机理的诸多学术研究成果的梳理与总结可知，哺乳动物初乳所含LF能够发挥出较为稳定的抗菌生活活性，其活性往往受限于自身对细菌胞膜的结合能力，同时受LF酶解多肽段的抗菌能力的影响。因此，人们可视LF蛋白为重要的抗菌类物质主体，是重要的展现膜结合能力的参与物质，同时充当着降解酶的重要基础物质。综上所述，LF的有效抗菌机理是先与细菌胞膜结合，使得LF发生一定的变构，提升对蛋白酶的敏感度， 且LF降解后可产生具有更高抗菌活性的多肽体，通过破坏细胞膜增加膜通透性来加快细胞内物质流失，从而达到杀菌的目的。