金丝桃苷抗抑郁作用参与5-HT能系统可能机制研究

郑梅竹，范亚军，潘 炎，时东方，刘春明

(1.长春师范大学中心实验室,吉林长春 130032；2.长春师范大学生命科学学院，吉林长春 130032；3.长春师范大学高等教育研究所，吉林长春 130032)

抑郁症是一种以心情低落、食欲不振严重时会产生自杀念头为显著特征的神经退行性疾病，严重危害现代社会人类的身心健康[1]。目前，对抑郁症的相关研究开展较多，但其确切的发病机制尚未明确。在已报道的众多发病机制中，去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)单胺神经递质与抑郁症的发病机理最为大众认可和接受。而单胺能系统在中枢神经中担任重要角色。尤其是5-HT能系统在抑郁症的治疗中占据重要地位。经典的抗抑郁药物盐酸氟西汀(百解忧)是基于显著提高人体内5-HT的含量发挥作用。目前，新的治疗抑郁症药物不断涌现，但由于其存在抗抑郁作用比较狭窄、且具有耐药性、同时因其毒副作用较大、用药后不良反应极其明显等缺点严重制约了在临床上的广泛使用，因此开发新型具有宽抗抑郁、高效低毒的抗抑郁药物成为研究的重要热点。而天然药物由于其来自自然且毒副作用小、有广阔的应用前景，越来越受到医务工作者和科研工作者的推崇[2]。

黄酮类化合物广泛存在于天然药用植物、水果和蔬菜中，具有利尿、清热、平肝和安神的功效，有研究表明在抗氧化、抗高血压和抗肿瘤方面具有明显的药理作用[3]，近年来，陆续报道了黄酮类化合物的抗抑郁作用[4-5]。而金丝桃苷是从黄酮类化合物中分离出来的单体成分，且含量较高，前期结果表明金丝桃苷具有明确的抗抑郁活性[6]，但其作用机制尚不明确。本研究在采用小鼠强迫游泳、小鼠悬尾和自主实验对金丝桃苷的抗抑郁活性进行进一步验证的基础上，选用5-HT相关受体(5-HT1A、5-HT2、5-HT2A)及其阻断剂Way100635、赛庚啶、酮舍林，深入研究金丝桃苷参与抗抑郁活性的5-HT能神经系统的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

金丝桃苷，购自上海源叶生物科技有限公司，纯度在99.9%以上；生理盐水，购自吉林大药房，批号：20150215。盐酸氟西汀胶囊，上海中西制药有限公司，批号：100102。受体阻断剂Way100635、cyproheptadine、ketanserin均购自美国sigma公司；DMSO，长春鼎国生物公司。

1.2 实验动物

体重18～22g雄性ICR小鼠,购自吉林长春生物制品研究所实验动物中心。动物在正常的12h光照,12h黑暗时间表下活动。环境温度和相对湿度分别保持在22±1℃和55±5%。

1.3 实验仪器

多功能细胞读板器(MD,Sunnyvale,CA.USA)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组和给药方法

五组实验小鼠，每组10只，设为对照组(生理盐水组)，阳性对照组(盐酸氟西汀胶囊，5mg/kg)，3个金丝桃苷给药处理组(给药浓度分别为10、20、30mg/kg)，所有药物通过灌胃以20mL/kg体重的剂量使用，1次/天，持续10天。最后一次给药1h后，开始进行动物行为学的检测。

1.4.2 小鼠强迫游泳试验

小鼠强迫游泳实验根据Porsolt建立的方法[7]进行检测。小鼠单独在开放的圆柱形容器(直径10cm，高25cm)中强迫游泳，该容器水温25±1℃，水深19cm，每只动物在6分钟的过程中保持不动的总时间被记录为不动时间(以秒为单位)。每只小鼠在停止挣扎时被判定为不动，并且在水中保持悬浮不动，只做出必要的动作以保持头部高于水面。不动时间的减少表明具有抗抑郁作用。

1.4.3 小鼠悬尾试验

尾部悬浮试验(TST)根据Steru等建立的方法[8]进行检测。使用悬尾夹子，在距离盒子(250mm×250mm×300mm)尾部10mm，头部距离底部5cm处将小鼠分别悬挂在尾部。在具有最小背景的黑暗房间中测试噪声，每只小鼠悬挂6分钟，在最后4分钟间隔记录不动时间。判定标准是小鼠停止挣扎，完全静止不动。

1.4.4 小鼠自主运动实验

为了评估金丝桃苷对小鼠运动行为的影响，将小鼠单独放置在暗室的矩形容器(40cm×40cm×25cm)中，配备有摄像机，自动记录小鼠在5min中内的自主活动情况。每个腔室的地板表面用70%乙醇彻底清洁。

1.4.5 金丝桃苷对给予5-HT相关受体阻断剂小鼠悬尾实验的影响

取健康小鼠40只，随机分为4组：生理盐水对照组，Way100635 0.1mg/kg组/cyproheptadine 5mg/kg组/ketanserin 3mg/kg组，金丝桃苷20mg/kg给药组，金丝桃苷20mg/kg+Way100635 0.1mg/kg组/cyproheptadine 5mg/kg组/ketanserin 3mg/kg组。灌胃给药，每天一次，持续十天，末次给药1h后，除生理盐水对照组、金丝桃苷20mg/kg给药组外，其余各组均皮下注射Way100635 0.1mg/kg/cyproheptadine 5mg/kg/ketanserin 3mg/kg，而对照组经皮下注射同等体积10mL/kg的生理盐水，30min后分别将小鼠尾部2cm处的部分固定于悬尾支架上，使小鼠呈倒挂状态，其头部离台面约5cm，每只动物两侧用板隔开，遮挡动物视线，使之互不干扰。适应1min，观察记录5min持续累计不动时间。

1.4.6 数据处理

所有数据以X±SD表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 金丝桃苷对小鼠强迫游泳行为的影响

金丝桃苷对小鼠强迫游泳行为影响实验表明阳性对照药盐酸氟西汀、金丝桃苷10mg/kg、20mg/kg给药组均能明显缩短小鼠强迫游泳累积不动时间(P<0.05)(表1)。

表1 金丝桃苷对小鼠强迫游泳行为的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 金丝桃苷对小鼠悬尾行为的影响

与对照组相比金丝桃苷10mg/kg、20mg/kg给药组能明显缩短悬尾小鼠的累计不动时间(P<0.05)，尤其是20mg/kg给药组与阳性对照组效果几乎一致(表2)。

表2 金丝桃苷对小鼠悬尾行为的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 金丝桃苷对小鼠自主运动行为的影响

金丝桃苷各给药组小鼠的自主运动情况与阳性对照和空白之间没有显著差异。结果表明在实验所使用的金丝桃苷抗抑郁剂量范围内没有明显的中枢兴奋或抑制作用(P>0.05)(表3)。

表3 金丝桃苷对小鼠自主运动行为的影响

2.4 5-HT1A受体阻断剂对金丝桃苷作用的影响

金丝桃苷给药组能明显缩短悬尾小鼠累计不动时间，与对照组差异显著(P<0.05)；但是金丝桃苷与5-HT1A受体阻断剂Way100635联合给药后对悬尾小鼠累计不动时间无明显的延长，与Way100635组和金丝桃苷组相比差异均不显著(P>0.05)(表4)。

表4 金丝桃苷对给予5-HT1A受体阻断剂Way100635小鼠悬尾试验的影响

注：与照组比，*P<0.05；与Way100635比，﹟﹟P<0.01。

2.5 5-HT2A受体阻断剂对金丝桃苷作用的影响

金丝桃苷给药组能明显缩短悬尾小鼠累计不动时间,与对照差异显著(P<0.05)；但是金丝桃苷与5-HT2A受体阻断剂cyproheptadine同时给药明显延长悬尾小鼠累计不动时间，与cyproheptadine组和金丝桃苷组相比差异显著(P<0.01)(表5)。

表5 金丝桃苷给予5-HT2A受体阻断剂Cyproheptadine小鼠悬尾试验的影响

注：与照组比：*P<0.05;与Cyproheptadine，##P<0.01;与金丝桃苷比，△△P<0.01。

2.6 5-HT2受体阻断剂对金丝桃苷作用的影响

金丝桃苷给药组能明显缩短悬尾小鼠累计不动时间,与对照组差异显著(P<0.05)；而金丝桃苷与5-HT2受体阻断剂ketanserin同时给药明显延长悬尾小鼠累计不动时间，与ketanserin组和金丝桃苷组相比差异显著(P<0.01)(表6)。

表6 金丝桃苷对给予5-HT2受体阻断剂ketanserin小鼠悬尾试验的影响

注：与照组比,*P<0.05；与ketanserin比,##P<0.01；与金丝桃苷比,△△P<0.01。

3 讨论

小鼠强迫游泳和小鼠悬尾是较为常用的、经典的抑郁症动物模型。模型所体现出的小鼠绝望、行为扭曲等状态是体外模拟抑郁症的显著特征，同时由于其对抗抑郁药物比较敏感且便于操作，因此是抗抑郁药物常用的筛选模型[9]。本研究采用这两种经典的抑郁动物模型对金丝桃苷的抗抑郁活性进行进一步的评价与验证。结果表明，金丝桃苷能显著缩短小鼠强迫游泳和小鼠悬尾的累积不动时间，同时对小鼠的自主活动没有明显的影响，表明金丝桃苷具有明确的抗抑郁作用。

抑郁症的发病机制比较复杂，包括受体假说、细胞因子假说、单胺假说等。其中单胺假说认为抑郁症的发病与神经递质水平的下降密切相关是最为大家广泛认可接受的。而单胺系统中5-羟色胺在突出间隙的缺乏或者水平持续下降在抑郁症的发病进程中起着重要作用[6]。5-HT能与其它的神经中枢相互传导，同时参与中枢神经对外部环境刺激所引起的适应性反应。Amat等[10]研究发现，在发生应激事件时大鼠中缝核的5-HT能神经元的活性被激活并大幅度的提升。Henn等[11]研究发现对于长期隔离饲养的大鼠，由于环境隔绝导致情绪低落，发现其海马内5-羟色胺能的释放量明显减少。Ruhé[12]等研究发现对于严重的抑郁症患者，在长期服药偶然停药后，会导致情绪低落，这与患者体内5-HT的缺失或其水平的急剧降低有密切关系。本研究结果证实金丝桃苷具有明确的抗抑郁活性，其作用机理与5-羟色胺能系统(5-HT2A、5-HT2受体系统)有确切的关系。金丝桃苷抗抑郁活性作用的发挥与其它神经递质是否存在密切的关系，需要进一步的深入探讨。