中缅树鼩Cyt b基因遗传多样性的研究

侯东敏, 王政昆, 杨 涛, 朱万龙

(云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室 云南师范大学 生命科学学院， 昆明 650500)

遗传多样性指的是生物遗传信息的总和[1]。通常研究的是种群内不同群体间或群体内不同个体间的遗传变异。遗传多样性的复杂程度对生物生存和发展很重要，所以就如何提高物种或者群体的遗传多样性具有重要的意义[2]。线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)是细胞核外的遗传物质，具有分子小而稳定、母系遗传、进化速度快等特点，进化速率远高于单拷贝核基因，适合用于群体遗传学分析的分子标记[3]。其中细胞色素b基因(Cytb)经常用于进化生物学、保护生物学、遗传多样性等方面，是适用性很强的分子标记[4-6]。

中缅树鼩(Tupaiabelangeri)隶属于攀鼩目(Sandentia)树鼩科(Tupaiidae)，是一类外形类似松鼠的小型哺乳动物物[7-8]。广泛分布于南亚、东南亚，在我国主要分布于云南、贵州、广西、四川及海南等地。大量研究表明，树鼩的进化地位和灵长类很接近，比啮齿类动物更接近于人类。再加上其易饲养、成本低、繁殖快和体型小易控制等原因被广泛应用于生物学和医学各个分支学科[9-10]。如今，随着国内外灵长类动物资源的匮乏以及模式动物小型化，树鼩已成为具有极大潜在价值的新型模式动物，受到越来越多的科研工作者的关注[11-12]。本实验利用Cytb基因探讨11个地理种群中缅树鼩的遗传多样性，为中缅树鼩成为新型实验动物模型提供一定的遗传基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物的处理

本实验所采用的实验样本来源于广西壮族自治区、四川省、贵州省、海南省以及云南省共计11个代表性地点，采集样本总数为124个。具体采集信息见表1。

表1 中缅树鼩采样点基本信息

1.2 DNA的提取

用E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit试剂盒提取总DNA。用琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA 的纯度，将完整性较强的DNA保存于-20℃备用。

1.3 引物及反应体系

Cytb基因的引物来源参照本实验室之前的研究[4]，引物序列(14071F：5′-GGATCTGACCAAGACCTGTGAC-3′；15320R：5′-TCCCTCCGTTTCTGGTTTAC-3′)。产物覆盖长度为1300 bp。PCR反应条件：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，58.0℃退火10 s，72℃延伸10 s，72℃再延伸5 min，总共30个循环数。PCR产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，在AlphaImager@ Mini凝胶成像仪上观察。将纯度较高的样品保存在-4℃冰盒中送至昆明硕擎生物有限责任公司进行双向测序。

1.4 统计分析

用Seqman软件查看Cytb基因的峰图。获得的序列用MEGA 5.05软件进行全序列的比对；并计算其遗传距离，构建进化树；用DnaSP软件计算单倍型数(H)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π)、变异位点(Vs)等分析碱基序列的遗传多样性；并计算各种群间的基因流(Nm)、分化指数(Fst)、平均核苷酸差异(Dxy)和净遗传距离(Da)探讨各种群间的分化程度；通过DnaSP软件计算各个地理种群的Tajima′s D和Fu′s Fs statistic检验、错配分布图，检测中缅树鼩在历史进程中有没有接受种群扩张。用Arlequin3.0软件计算种群间的分子变异分析。线粒体Cytb总体序列的进化树是先由MEGA软件基于Kimura双参数法计算出遗传距离，然后利用邻接法(Neighbor-joining)，使用最大组成似然模型(Maximum Composite Likelihood，MCL)，检测数为1000次，构建进化树。进化树上的每一小枝代表一个样本，节点处的数值NJ分析获得的支持率，枝长代表分歧度。

2 结果

2.1 线粒体Cyt b基因碱基组成分析

通过分析中缅树鼩线粒体Cytb基因测序结果，序列片段总长度为1073 bp，A、T、G、C比例分别为26.9%、28.9%、29.1%和15.1%，A+T(55.8%)的比例高于C+G(44.2%)。

2.2 线粒体Cyt b基因碱基多样性分析

表2中显示出了中缅树鼩124个样本的Cytb基因碱基的变异位点和遗传多样性，其中样本总体的单倍型个数为66个，变异位点数为262个，单倍型多样性为0.981，平均核苷酸变异数为51.789，核苷酸多样性为0.051 70。各个种群中，腾冲种群的单倍型和核苷酸多样性最高，西昌种群的单倍型多样性最高。

2.3 线粒体Cyt b基因单倍型分布

由DnaSP软件确定了66个单倍型，占总样本量的53.66%。其中有58个单倍型是各个种群所特有类型，占所有种群的87.9%；有8个共享单倍型(H4、H9、H27、H30、H34、H36、H38及H54)。具体各单倍型的分布详见表3。

表2 不同种群Cyt b基因序列的变异位点和遗传多样性

2.4 线粒体Cyt b基因进化树分析

由图1看出进化树分出的4大支可信度很强，这4支分别是大新种群一支、海南种群一支、片马和腾冲种群一支，其余种群聚为一支。说明中缅树鼩种群出现了一定的种群分化。

表3 中缅树鼩Cyt b基因采样点及单倍型信息

2.5 线粒体Cyt b基因AMOVA分析

由表4可知，种群间的方差占总变异的75.12%，种群内的方差占总变异的24.88%，表明变异主要发生在种群间。且Fst的值大于0.25小于1(Fst=0.75119)，表明不同树鼩种群间已出现高度的遗传分化。

2.6 线粒体Cyt b基因的遗传距离

通过计算各种群间的基因流(Nm)、分化指数(Fst)、平均核苷酸差异(Dxy)和净遗传距离(Da)探讨各种群间的分化程度。表5中，中缅树鼩11个地理种群间的基因流均小于1。说明各地理种群间的存在的基因交流非常弱，种群间可能发生了一定的种群分化。在遗传距离当中，海南种群明显高于其他种群；大新、海南及其他种群的核苷酸分歧度较大；大新种群和其他种群的净遗传距离较大。

图1 线粒体Cyt b基因基于邻接法构建的进化树

变异来源Source of variation自由度Degree of freedom平方和Sum of squares方差组分Variancecomponents变异百分率Percentage of variationFst种群间Inter-populations102703.70023.609 93Va75.12种群内Iutra-populations112875.8367.819 97Vb24.88总变异Total variation1223579.53731.429 890.751 19

Va表示种群间方差组分；Vb表示种群内方差组分

表5 中缅树鼩11个种群的扩张检测

2.7 线粒体Cyt b基因的扩张性检测

从表5中可以看出只有乐业种群的Tajima′s D的P值小于0.05且差异显著，错配分布曲线呈不规则多峰型，说明中缅树鼩总体没有接受种群扩张。

3 讨论与结论

碱基组成偏向性是指一个基因组的DNA序列上4种碱基不均一的分布，个别碱基出现不同程度富集或是偏低的现象，这种现象是由突变、自然选择、随机遗传漂变、基因组结构等多种因素相互作用的结果[13-14]，可以反映出特定基因组在结构和进化方面的总体特征[15-16]。本实验基于线粒体细胞色素b基因1073 bp的序列分析了中缅树鼩11个地理种群，表明A+T含量高于C+G含量，说明在Cytb基因中碱基比例出现一定程度上的碱基组成偏向性。

Cytb基因总序列中共发现单倍型个数为66个，说明中缅树鼩具有较高的遗传多样性。群体中mtDNA核苷酸多样性是衡量群体多态程度的重要指标，值越大，群体多样性程度越高[17-20]。本实验中检测到中缅树鼩的核苷酸多样性为0.051 70。相对较高H值和较低π值表明中缅树鼩这个种群可能是由一个较小的有效种群经历瓶颈效应或建群者效应后迅速增长，导致单倍型因变异使得多态性积累，但核苷酸序列的多样化还未能积累[21-25]。核苷酸多样性最高的是腾冲种群，为0.061 44，最低的是昆明种群，为0.002 97，说明腾冲种群具有较高的遗传多样性。单倍型多样性的值同样可以用来判断一个种群的多态性，本实验中各个种群单倍型多样性的取值范围为0.553～0.948，最高值和最低值的分别是西昌种群和乐业种群。本实验检测到11个地理种群的变异位点数为262个，并通过AMOVA分析发现，变异主要发生在种群间，且已经出现较高的遗传分化。进一步对中缅树鼩总序列构建进化树发现，11个地理种群分为4大支，且可信度达到99，大致可以把11个地理种群分为海南种群、大新种群、腾冲片马种群和其他种群。

中性检测和扩张检测可以用来判断种群经历的历史事件[26-28]。中性检验中Tajima′s D值是否显著来推测种群在过去是否发生过扩张，通过考察各个种群的核苷酸不匹配曲线是否呈单峰型或多峰型，也可以检测种群是否发生过扩张。从表5可以看出中缅树鼩总体样本的Tajima′s D和Fu′s Fs statistic检验结果都不显著，表明中缅树鼩未经历种群扩张。

综上所述，中缅树鼩11个地理种群具有较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性，表明中缅树鼩可能经历过瓶颈效应或建群者效应。种群变异分析表明11个地理种群可能已经出现分化，大致分为4个类群：海南种群、大新种群、腾冲片马种群和其他种群。