高压均质法提取药用真菌多糖的研究

龚劲松， 袁 峰， 袁兵兵， 陈 露， 陆震鸣， 王英燕， 赵伏梅， 徐国华， 史劲松， 许正宏

(1. 江南大学 药学院 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室， 无锡 214122； 2. 江苏神华药业有限公司 江苏省药用真菌生物工程技术研究中心， 淮安 211600)

药用真菌可产生数量众多的活性代谢产物，如蛋白质、多糖、氨基酸、维生素、生物碱、萜类化合物、甾醇、酚类、酶、核苷、有机酸等，且很多具有抗癌、降血糖、降血脂、抗氧化等多种功效。猴头菌(Hericeumerinaceus)是一种珍贵的药用真菌，又称猴头菇、猴菇、刺猬菌等，属于担子纲[1]。猴头菌中含有丰富的葡萄糖、海藻糖、甘露醇等可溶性糖，同时其菌体中也存在种类多样的各种氨基酸和芳香族化合物，这些物质造就了该药用真菌所具备的得天独厚的功效与风味[2-4]。传统中医记载，猴头菌具有性平味甘的特征，在调理五脏六腑、改善消化道功能、营养保健等方面具有良好的功效，截至目前已被成功应用于治疗胃溃疡、消化不良、免疫低下、神经衰弱等领域[5-6]。

随着技术的进步，人们对猴头菌H.erinaceus药用价值的认识也逐步深入，猴头菌的抗衰老、抗癌、抗消化紊乱、神经保护等作用逐渐得到证实与报道，猴头菌内的各有效活性组分也得到了针对性研究[7-8]。围绕猴头菌体内的重要组分多糖，目前已制备得到多种具有代表性的糖类组分。随着目前社会老龄化来临，老年人口数量在逐年增多，而患阿尔兹海默症的老年人也在快速增加。研究发现猴头菌在预防和治疗老年痴呆方面具有良好的应用价值，目前已分离获得多种能用于改善或治疗阿尔兹海默症的猴头菌相关组分。猴头菌在医药领域的价值总结起来主要包括如下方面：1)抗炎及治疗溃疡；2)提升肌体对缺氧环境的耐受能力；3)改善心肌血液流量，促进机体血液循环；4)缓解疲劳；5)降血糖降血脂降血压；6)保肝护肝；7)抗肿瘤；8)抗氧化、缓解衰老等[9-10]。

截至目前已报道的猴头菌H.erinaceus活性成分众多，其中多糖、萜类、酚类、甾醇类、脂肪酸等物质被广泛作为研究对象，而多糖是猴头菌研究工作中的重要目标[11-12]。分析表明，猴头菌H.erinaceus多糖成分以葡萄糖、甘露糖以及半乳糖为主，其中葡萄糖含量最高，它是以不同键型连接而成的葡聚糖，其中主链由β(1→3)键所连接，支链由β(1→6)键连接而成，其相对分子量约为40 ku[13]。早期有研究报道认定猴头菌H.erinaceus的子实体多糖主要组分是1∶1的葡萄糖和半乳糖，而菌株品种和检测方法的不同也可能导致最终的猴头菌多糖组分存在差异[14]。上海农业科学研究院张劲松团队采用GC法分别对猴头菌H.erinaceus子实体和菌丝体多糖进行了系统检测分析。结果显示，子实体多糖样品中的单糖组分丰富，主要包括有葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖，而菌丝体所提取的多糖样品中的单糖组分与子实体则表现出一定差异，除葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖外，还检测到了显著的木糖存在[15]。

真菌多糖是一类重要的生物活性物质，目前相关研究主要集中于真菌多糖的分离提取、含量分析检测、物质结构解析、药理活性评价等领域[16]。然而，已报道的真菌多糖仍然多为杂多糖，深入研究具有一定困难，另外，真菌的生长环境、提取制备工艺的不同也会影响到多糖的结构及其生物活性。目前尽管已有多种真菌多糖应用于临床，但质量及品质不易控制，药效重复性偏低，与国际规范标准有一定差距，严重限制了真菌多糖在医药行业的广泛应用[17]。开展真菌多糖的提取工艺研究，是进行产品开发的基础。猴头菌及其多糖在医药、生物、保健、食品、美容等工业中具有极具潜力的研究价值和应用前景，市场需求也逐年增加，因此作者对猴头菌多糖的分离提取工艺进行了探索性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

菌种来源：猴头菌H.erinaceus来自于江苏神华药业有限公司(江苏金湖)，并由本实验室于4℃保藏。

1.1.2 培养基及组分

1)PDA斜面培养基(g/L)：土豆 200，葡萄糖 20，琼脂 20，自然pH值；

2)液体种子培养基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 10，花生饼粉 10，KH2PO43，MgSO41.5，pH 6.0；

3)发酵培养基配方与种子培养基相同。

1.1.3 化学试剂

实验主要试剂及来源见表1。

表1 实验主要试剂及来源

1.2 实验仪器与设备

本实验涉及的相关仪器如表2所示。

表2 主要仪器设备

1.3 实验方法

1.3.1 液体深层发酵制备菌丝体

本实验采用5 L发酵罐进行猴头菌H.erinaceus的液体深层发酵，以制备获得其菌丝体。H.erinaceus发酵培养的接种量按10%进行，通气量为1V/V·min，置于28℃及200 r/min发酵4 d。为收集获得猴头菌H.erinaceus菌丝体，将按照以上方式培养获得的发酵液在8000 r/min条件下离心10 min，并计算其含水量。

1.3.2 3种提取方法所得猴头多糖的比较

1)高压均质法。准确称量20 g猴头菌丝体加入300 mL ddH2O中，采用Panda Plus 2000高压均质机在最优条件下进行均质破碎，操作压力设定为80 MPa，均质次数设置为3次，通过循环冷凝水进行温度控制；高压均质结束后，在冷冻离心机中8000 r/min的离心条件下离心10 min，将上清液在50℃条件下减压浓缩后，按照体积比1∶3加入无水酒精，在4℃过夜处理，沉淀在冻干机上经冷冻干燥收获猴头菌H.erinaceus胞内多糖。

2)超声提取法。准确称量20 g猴头菌丝体加入300 mL ddH2O中，在冰浴条件下进行细胞破碎。仪器：新芝JY92-II超声破碎仪，功率200 W，操作周期40 min(其中运行10 s停5 s)。经镜检确认细胞充分破裂后，在离心机中设置8000 r/min离心10 min，浓缩液按照体积比1∶3加入无水酒精，于4℃醇沉过夜，再经冻干处理后收集多糖样品。

1.3.3H.erinaceus胞内多糖相关指标的测定

1)总糖、蛋白和还原糖含量。①总糖含量。按照文献报道的苯酚-硫酸法[18]测定H.erinaceus多糖经分步醇沉所得各组分的总糖含量。具体实验操作步骤如下：

对照品溶液的制备：在分析天平上精确称取适量无水葡萄糖样品，经105℃烘箱干燥至恒重，配制成浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

供试品溶液的制备：精确称取适量H.erinaceus多糖样品，加ddH2O充分溶解配制成0.5 mg/mL的样品溶液。

标准曲线的制备：将上述制备获得的标准溶液按照以下体积准确吸取添加至具塞的玻璃试管中：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL，将其体积用ddH2O补齐至2.0 mL，继而在该玻璃试管中加入1.0 mL、6%的苯酚溶液，待摇匀后再快速加入5 mL浓硫酸，在室温条件下反应30 min，将样品再次充分混合均匀，以不加入葡萄糖的0号玻璃试管作为空白对照，通过分光光度计检测各个样品在490 nm处的吸收值。最后根据葡萄糖浓度及与检测得到的吸收值计算获得回归方程。

样品的检测：取待检测样品配成的溶液2.0 mL，在分光光度计上测定该样品在490 nm处吸收值，并根据回归方程可计算出该样品总糖含量。

②蛋白含量。采用上海生工生物工程有限公司提供的Folin-酚试剂盒检测猴头菌H.erinaceus胞内多糖各组分的蛋白含量。

根据敏感性分析结果，选取油水界面、孔隙度下限值、主变程3个主要敏感性因素开展该次不确定性分析，采用蒙特卡洛辅以拉丁超立方和正交阵列采样方式，设置实现次数81次。结果表明，J油田储量分布范围：P10为1901.87万m3、P50为2114.64万m3、P90为2372.11万m3(图7)。P50是储量分布中频率最高值即最可能值，推荐其作为开发方案编制的基础，而针对P10设置风险方案，针对P90设置潜力方案。

③还原糖含量。胞内多糖样品的还原糖含量采用DNS法进行测定[19]。

2)单糖组成。本研究采用气相色谱仪(GC)进行猴头菌H.erinaceus胞内多糖样品的单糖组分分析。样品中多糖的水解操作步骤如下，精确称量20 mg猴头菌H.erinaceus多糖粉末置于专用水解管中，在管中添加2 mL 1 mol/L的硫酸溶液，将管口完全封闭，于100℃沸水中充分水解4 h，水解液通过BaCO3进行中和，经过滤去除杂质及沉淀，将样品的滤液单独回收，置于冻干机上，低温条件下真空干燥，获得游离的单糖组分。

衍生化过程操作步骤如下，准确称取干燥所得单糖样品粉末适量，分别在样品中加入10 mg盐酸羟胺、2 mg肌醇、0.5 mL吡啶，将反应体系置于90℃的恒温热水浴中，保温30 min；待其冷却后再添加0.5 mL乙酸酐，于90℃继续温浴30 min，样品冷却后可通过GC进行单糖含量分析。GC的操作条件参考文献[20]。

3)红外光谱分析。准确称量猴头菌H.erinaceus胞内多糖各组分样品1～2 mg，采用KBr压片法对各多糖样品进行红外光谱(FT-IR spectra)检测分析。

2 结果与讨论

2.1 不同方法所提取H. erinaceus胞内多糖的得率

本研究首先探究了动态高压均质法的提取条件，并采用最优提取条件下的高压均质法提取猴头菌H.erinaceus胞内多糖。实验结果表明，采用动态高压均质法、超声提取法和热水提取法3种不同方法所得猴头菌胞内多糖的得率分别为16.42%、5.12%和4.81%(表3)。由结果可以看出，采用高压均质法所提取的猴头菌胞内多糖得率最高，相比传统的超声提取法和热水提取法得率高出约3倍。分析其原因，可能由于高压均质过程会产生多种机械和物理效应，包括剪切力、撞击力以及空化效应等，使得猴头菌H.erinaceus细胞内多糖能快速充分释放至胞外，从而显著提升了其多糖的提取得率。

另外，经不同提取方法所制备获得的猴头菌H.erinaceus胞内多糖均呈现粉末状，颜色也具有一定差异，其中，采用动态高压均质法及超声法所得的多糖颜色相比热水法较浅，究其原因，可能为热水的高温使多糖样品分子间发生了美拉德反应，导致了样品颜色变深。

表3 采用不同方法提取猴头胞内多糖得率情况

2.2 胞内多糖化学组成及分子性质

2.2.1 总糖、蛋白、还原糖含量

由表4可知，动态高压均质法所得猴头菌H.erinaceus多糖的总糖为57.11%，与超声提取法和热水提取法基本接近，后两者分别为58.45%及60.23%，其中传统的热水法所得多糖中总糖含量为最高；另一方面，高压均质提取法所得蛋白含量则最高，热水提取法最低。分析其原因，可能归于高温使布朗运动加剧，分子颗粒运动更加激烈，分子量较高的多糖在此条件下易于更多的扩散至水中，最终提升了样品中总糖含量，与此同时，温度升高也会使得蛋白发生降解，因此检测到的蛋白含量相应偏低；另外，高压均质提取法所得还原糖含量也为最高，可能归于物理操作的剪切力使得样品部分糖苷键发生断裂，猴头菌H.erinaceus多糖样品中的还原糖含量因此而相应获得提升。

表4 不同方法提取猴头菌胞内多糖的总糖、蛋白和还原糖相对含量

2.2.2 分子量分布

表5为高压均质、超声和热水提取3种不同方法所提取的猴头菌H.erinaceus胞内多糖的分子量分布。对3种不同提取方法所得多糖分子量的分析结果表明，热水提取法所得多糖分子量最高，而高压均质法和超声法所提取的多糖分子量相对偏小，这反映出高压均质法和超声法在操作过程中所产生的机械剪切力可能导致多糖部分糖苷键断裂，致使猴头菌H.erinaceus胞内多糖的最终分子量偏低，不过其工艺操作周期较短，因而这两种方法所得产品的分子量降低幅度相比热水提取法差异也并不明显。

表5 3种提取方法所得猴头菌胞内多糖的分子量分布情况

Mn、Mp和Mw分别代表数均、峰位和重均分子量

2.2.3 单糖组成

图1所示为3种不同方法所提取猴头菌H.erinaceus胞内多糖的单糖组成，实验检测结果表明样品中包括岩藻糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖，但是其含量分布并不一致，这可能归因于多糖种类不同所导致的差异。此外，从图1中也可以看出，半乳糖是猴头菌多糖样品的单糖组成中含量最高的组分，而其中阿拉伯糖和葡萄糖含量则次之。

2.2.4 红外光谱分析

如图2所示为采用高压均质、超声和热水提取3种不同方法提取所得猴头菌H.erinaceus胞内多糖的红外光谱图。不同类型的官能团在红外光谱图中特征峰的出峰位置和形状相应会有所差异。根据本实验红外分析结果来看，采用不同提取方法所得猴头多糖样品的出峰位置和峰形基本一致。如图2，在3390 cm-1处出现了较显著的吸收峰，为羟基的O-H伸缩振动吸收峰；在2930 cm-1处出现的较弱吸收峰则是烷基的C-H伸缩振动吸收峰；在1640 cm-1处出现的较强吸收峰则是羧基的C=O非对称伸缩振动，根据结果分析来看，该样品中可能具有糖醛酸结构。

图1 采用不同提取方法所得猴头胞内多糖的单糖组成分析

图2 采用3种不同方法所提取的猴头胞内多糖的红外光谱图

3 结论

1)本实验综合比较了高压均质提取法、热水提取法、超声提取法这3种不同方法所提取猴头菌胞内多糖的提取得率以及各项指标。实验结果表明，高压均质法的提取效率较高，猴头菌胞内多糖的提取得率可达到16.42%，显著优于传统方法。

2)3种不同方法提取所得猴头菌胞内多糖的总糖含量基本接近，高压均质提取法含量为57.11%，而热水提取法相对较高，为60.23%；蛋白含量为26.34%、15.45%和10.12%；还原糖含量分别为3.71%、2.93%及2.44%；多糖的分子量分布方面，热水提取法多糖分子量略高于高压均质法和超声提取法。进一步的红外光谱分析结果显示，不同方法所得多糖的一级结构基本一致。