代谢中间物对斜生栅藻叶绿素荧光特性以及油脂积累的研究

成 杰， 武 迪， 钱改改, 巩东辉,2， 苏勇宁， 陈 高 ， 季 祥,2

(1. 内蒙古科技大学 生命科学与技术学院， 包头 014010； 2．内蒙古自治区生物质能源化利用重点实验室， 包头 014010； 3. 厦门大学 海洋与地球学院， 厦门 361000；4. 山东省农业科学院 生物技术研究中心, 济南 250000； 5. 内蒙古再回首生物工程有限公司， 鄂尔多斯 016100)

能源是推动人类社会发展的重要基础，化石能源的使用同时也带来了环境污染、温室效应等严重的问题[1-2]。生物燃料(Biofuel)由于环境友好、可再生性而备受关注[3-4]。生物柴油作为液体燃料可直接应用于柴油机等常规设备[5]。能源微藻具有光合效率高、成本低、含油量高、生产效率高等优点[6-9]，被认为是未来生物柴油的主要原料[10-11]。目前微藻生物柴油成本较高[12]，而降低能源微藻成本的关键在于：1)选育获得高效适合工业化生产的藻株；2)建立利用低成本规模微藻培养技术和设备；3)进一步提高藻细胞内的油脂含量。

通过调控藻细胞油脂代谢途径来提高藻细胞油脂积累是目前研究的热点。本研究选取了苹果酸、柠檬酸两个中间代谢物，通过调控与乙酰辅酶A相关的代谢反应，促使代谢流向油脂合成的方向移动，为进一步揭示油脂代谢中的关键调控因子，为促进微藻生物能源研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料及处理

藻种斜生栅藻(ScenedesmusobliquusXJ002)为内蒙古自治区生物质能源化利用重点实验室保存。取若干个250 mL锥形瓶，分别向其中加入一定数量的经高压蒸汽灭菌BG11培养基以及柠檬酸、苹果酸储备液，使每个锥形瓶中柠檬酸、苹果酸的终浓度分别为0.00、0.01、0.05和0.15 g/L，每组重复3次。 然后加入XJ002藻株，摇匀，藻液的最终体积为 150 mL，初始OD680值为0.270，置于光照培养箱中培养。培养温度为25℃±1℃，光照强度4800 lx，光暗周期14 h∶10 h，静置培养，每天定时摇匀3次，并每隔24 h 改变各锥形瓶的位置。

1.2 实验方法

藻细胞内光合色素的提取参照Sartory等[13]方法。藻细胞叶绿素荧光特性通过植物效率分析仪(PEA, Hansatech)测定。测定前，取不同处理组的藻细胞，利用BG11基础培养基将各个处理组的吸光度OD680调成同一水平，并置于暗环境中30 min，在暗环境中进行测定操作。各荧光参数的意义见表1。取培养至对数生长期后期的各处理组藻液适量，尼罗红染色测定藻细胞内油脂含量(%)。

2 结果与讨论

2.1 代谢中间物的添加对XJ002藻株生物量的影响

图1表示在藻细胞一个培养周期(15 d)内，柠檬酸与苹果酸对XJ002藻细胞生物量的影响。由图1可知，从第2天开始，不同浓度柠檬酸与苹果酸处理对藻细胞生物量的影响表现出一定的差异。低浓度的柠檬酸与苹果酸处理对藻细胞生长影响不大，高浓度的柠檬酸与苹果酸处理，藻细胞的生长状态受到明显的抑制，0.15 g/L 的苹果酸与柠檬酸处理组的藻细胞生物量比对照组分别降低了23.08%和21.21%(P<0.01)。藻细胞只有在一定的pH值范围内(7.7 ～ 9.4)才可以保持良好的生长状况，超出这个范围，藻细胞的各项生理功能会受到影响，导致藻细胞生长缓慢，甚至引起藻细胞的死亡。外源柠檬酸与苹果酸的加入会降低培养基中的pH值，培养基中过低的pH值对藻细胞的生长代谢、光合作用以及藻细胞对营养盐的摄取都会产生显著地影响。

表1 JIP-测定所用的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(O-J-I-P)的参数

图1不同浓度代谢中间物处理对XJ002藻细胞生长的影响

Fig 1 Effect of various concentrations of metabolic intermediates
on the biomass ofScenedesmusobliquusXJ002

A:柠檬酸；B：苹果酸

2.2 代谢中间物的添加对XJ002藻株光合色素的影响

表2表明，不同浓度柠檬酸与苹果酸处理条件下，XJ002藻株胞内的光合色素具有显著的差异。低浓度的柠檬酸与苹果酸处理对藻细胞光合色素的积累具有轻微的促进作用，随着柠檬酸与苹果酸浓度的增加，叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素均出现下降的总体趋势。与对照组相比，0.15 g/L柠檬酸处理时，叶绿素a与类胡萝卜素分别下降了45.02% 和 48.92%(P<0.01 )。当0.15 mol/L苹果酸处理时，叶绿素a与类胡萝卜素分别下降了40.70%和43.25%(P<0.01 )。与苹果酸相比，柠檬酸降低的幅度更大。叶绿素a作为捕光色素蛋白复合体的重要组分与光合作用密切相关。研究结果表明，高浓度的柠檬酸与苹果酸处理会降低藻细胞内光合色素含量，导致光合效率的下降，进而抑制藻细胞的生长。

表2 不同浓度柠檬酸与苹果酸对斜生栅藻胞内光合色素含量的影响

2.3 添加外源代谢中间物对XJ002藻株叶绿素荧光参数的影响

2.3.1 添加外源代谢中间物对XJ002藻株叶绿素荧光诱导动力学曲线的影响

由图2可知，不同浓度中间代谢物处理15 d后各处理组的快速叶绿素荧光诱导动力学曲线有着显著的差异。低浓度的柠檬酸与苹果酸处理下，藻细胞快速叶绿素荧光诱导动力学曲线较为集中，随着柠檬酸与苹果酸处理浓度的增加，曲线依次呈现出下降的总体趋势。低浓度的柠檬酸处理组的曲线与对照组有轻微的差异，而低浓度的苹果酸处理组的曲线与对照组基本没有差异，说明藻细胞对柠檬酸的毒性效应更敏感。

图2 不同浓度代谢中间物处理对XJ002藻细胞叶绿素荧光诱导曲线的影响

A:柠檬酸；B：苹果酸

2.3.2 代谢中间物的添加对XJ002藻株光合作用光系统II反应中心供体侧的影响

Wk值是衡量藻细胞PSII反应中心供体侧放氧复合体是否受损的唯一指标，Wk值的增加说明PSII反应中心供体侧的放氧复合体受损，进而影响了PSII反应中心供应电子的能力以及向下游传递电子的效率。由图3可知，低浓度的柠檬酸与苹果酸处理导致藻细胞Wk值出现轻微下降的趋势，高浓度的柠檬酸与苹果酸处理引起藻细胞Wk值出现显著增加，当0.15 g/L柠檬酸与苹果酸处理藻细胞时，Wk值分别是对照组的1.037 倍和1.021 倍(P<0.05)。结果表明高浓度的柠檬酸与苹果酸处理破坏了PSII反应中心供体侧的放氧复合体结构。

图3 不同浓度代谢中间物处理对XJ002藻株光系统II反应中心供体侧Wk值的影响

2.3.3 代谢中间物的添加对XJ002藻株光合作用光系统II反应中心的影响

1)代谢中间物的添加对光系统II最大光化学效率(Fv/Fm)以及基于吸收光的光性能指数(PIabs)的影响。PSII反应中心最大光化学效率(Fv/Fm)通常被用于反映PSII光化学效率以及预测植物受胁迫程度。一般而言，Fv/Fm值在非胁迫条件下基本保持不变，而且不受物种与环境的影响。当藻细胞受到外界环境胁迫时，Fv/Fm值会出现显著变化，因而可以作为细胞受到胁迫的指示器。本研究中，不同浓度有机酸处理下，Fv/Fm值基本保持不变；低浓度的有机酸处理对光性能指数(PIabs)的影响不大，高浓度的有机酸处理导致PIabs呈现出下降的趋势。由图4可知，与对照组相比，当0.15 g/L柠檬酸与苹果酸处理藻细胞时，PIabs值分别降低了16.44% 和0.34%。

2)代谢中间物的添加对XJ002藻株光合作用光系统II反应中心能量分配的影响。ABS/RC是指单位反应中心吸收的光能，DIo/RC是指反应中心用于热耗散的能量，ETo/RC是指反应中心用于电子传递的能量。由图5可知，外源柠檬酸处理对光系统II(PSII)反应中心能量分配影响不大。随着柠檬酸处理浓度的增加，ABS/RC基本不变，DIo/RC基本不变，ETo/RC有所降低。当0.15 g/L柠檬酸处理藻细胞时，ETo/RC值比对照组分别降低了4.66% (P<0.01 )。外源苹果酸处理对光系统II(PSII)反应中心能量分配基本没有影响。

图4 不同浓度代谢中间物处理对光系统II最大光化学效率(Fv/Fm)以及基于吸收光的光性能指数(PIabs)的影响

图5 不同浓度代谢中间物处理处理对光系统II反应中心能量分配的影响

2.3.4 代谢中间物的添加对XJ002藻株光合作用光系统II反应中心受体侧电子传递活性的影响

由图6-A可知，随着柠檬酸处理浓度的增加，ETo/ABS与ETo/TRo出现降低的总体趋势，当0.15 g/L柠檬酸处理藻细胞时，ETo/ABS值与ETo/TRo值比对照组分别降低了8.24%和 8.10%(P<0.01)。由图6-B可知，外源苹果酸处理对ETo/ABS值影响不大，随着苹果酸处理浓度的增加，ETo/TRo出现降低的总体趋势，当0.15 g/L柠檬酸处理藻细胞时，ETo/TRo值比对照组分别降低了3.50%。图6-C可知，Mo随着柠檬酸处理浓度的增加表现出上升的总体趋势，各处理组间差异显著(P<0.01 )。当柠檬酸处理浓度为0.15 g/L时，Mo值是对照组的1.09倍(P<0.01 )；Sm随着柠檬酸处理浓度的增加表现出上升的总体趋势，各处理组间差异显著(P<0.01)。当柠檬酸处理浓度为0.15 g/L时，Sm值是对照组的1.13倍(P<0.01)。当柠檬酸处理浓度为0.15 g/L时，VJ值是对照组的1.05倍(P<0.01)。图6-D可知，高浓度的苹果酸处理浓度的增加导致Mo、Sm、VJ值均存在增加的趋势，各处理组间差异显著(P<0.01)。当苹果酸处理浓度为0.15 g/L时，Mo、Sm、VJ值是分别是对照组的1.04、1.13和1.23倍(P<0.01)。

图6 不同浓度代谢中间物处理对光系统II反应中心受体侧电子传递活性的影响

图7 不同浓度代谢中间物处理对XJ002藻细胞总脂含量的影响

2.4 添加外源代谢中间物对XJ002藻株胞内总脂含量的影响

由图7可知，外源柠檬酸与苹果酸的添加对XJ002藻细胞总脂含量产生了显著的影响。随着柠檬酸、苹果酸处理浓度的增加，XJ002藻株胞内总脂含量(%)会有显著提高。当柠檬酸与苹果酸处理浓度为0.15 g/L时，XJ002藻株胞内总脂含量是对照组的1.85倍和1.34倍。与苹果酸相比，柠檬酸的处理效果更佳。

各种脂肪酸从头合成途径中，合成的原料是各种代谢过程产生的乙酰辅酶A，通过调控培养条件，研究细胞内碳原子的流向，引导碳代谢流向油脂合成的方向。通过对油脂合成起主要作用的碳代谢途径分析，本研究选取了苹果酸、柠檬酸两个代谢中间物，它们在胞内均可通过参与三羧酸循环调控乙酰辅酶A的代谢，后者可以用于藻细胞油脂的合成。结果表明，外源柠檬酸与苹果酸的添加可以提高XJ002藻细胞总脂含量，外源添加低浓度的柠檬酸与苹果酸，强化了藻细胞内碳代谢途径，在保证藻细胞生物量基本保持不变的情况下还可以进一步促进藻细胞内总脂的含量。除此之外，高浓度的柠檬酸与苹果酸的添加抑制了藻细胞的光合作用，使得胞内更多的碳原子用于中性脂的合成，从而使得总脂的含量有了一定程度的提高。

3 结论

高浓度柠檬酸与苹果酸的添加导致XJ002藻细胞生物量、叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量显著下降。与此同时，破坏了光系统II反应中心供体侧放氧复合体的结构，抑制了反应中心供体侧和受体侧电子传递活性，显著提高了XJ002藻株胞内总脂含量，与苹果酸相比，柠檬酸的添加效果更佳。