复方红景天口含片质量标准研究*

宋 薇

甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

复方红景天口含片是由红景天、制何首乌、黄精及甘草4味中药组成的纯中药复方制剂，具有抗衰老，抗疲劳，改善记忆力，预防和治疗老年痴呆的功效。为了更好地控制复方红景天口含片的质量，本试验采用薄层色谱(TLC)法对该方中的红景天、何首乌、黄精药材进行了定性鉴别；采用高效液相色谱(HPLC)法对红景天中的红景天苷及酪醇进行测定，所建立的方法简便、可靠、重现性好，能保证制剂的质量。

1 材料

1.1仪器Aglient1120型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；AE260型万分之一电子天平(瑞士Mettle公司)；CP225D型十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)；R-200型旋转薄膜蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；SHZ-D型循环水式真空泵(河南巩义市予华仪器有限责任公司)；SK3310LHC型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2试药红景天苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110818-200401)；酪醇对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111676-200401)；2，3，5，4′- 四羟基二苯乙烯 -2-O-β-D- 葡萄糖苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110844-200606)；复方红景天口含片(甘肃省医学科学院提供，批号：2009091701、2009091702)；所需药材由兰州安泰堂中药饮片有限公司提供，经甘肃省中医院何福江实验员鉴定符合《中国药典》2010版(一部)，乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 定性鉴别

2.1红景天的鉴别称取已粉碎过筛的不同批次复方红景天口含片各2 g，加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，滤过，合并滤液旋转蒸发仪蒸干，残渣加5 mL甲醇溶解，作为供试品溶液备用。分别称取红景天苷和酪醇对照品，加入甲醇配制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。称取缺红景天的复方红景天口含片2 g，按口含片供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。称取红景天药材粉末5.0 g，加入100 mL70%乙醇连续回流提取2小时，过滤，蒸干，甲醇溶解定容至10 mL，取出5 mL蒸干，50 mL水溶解，用水饱和正丁醇萃取至无色，合并萃取液，蒸干，甲醇溶解，制成供试品溶液。吸取上述溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-丙酮(6∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，以碘蒸气熏至显色清晰。结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰，见图1。

图1 红景天的TLC

2.2何首乌的鉴别称取已粉碎过筛的不同批次复方红景天口含片各2 g，加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，滤过，合并滤液旋转蒸发仪蒸干，残渣加5 mL甲醇溶解，作为供试品溶液备用。称取二苯乙烯苷对照品，加甲醇溶解配制成1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。称取缺何首乌的复方红景天口含片2 g，按口含片供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。称取0.271 4 g制何首乌标准药材加95%乙醇50 mL浸泡30分钟，回流提取2次，1 h/次，合并滤液，浓缩至约3 mL，作为标准药材对照品溶液。吸取上述溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-丙酮-水(6∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在 365 nm 荧光下观察，斑点清晰。结果：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰，见图2。

3 含量测定

3.1红景天苷及酪醇含量测定

3.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5 μm)；预柱：ZORBAXSB-C18(4.6mm ×12.5 mm)；流动相：乙腈 - 水(15∶85)；流速：1.0 mL/min；检测波长：320 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。

3.1.2 系统适应性试验 分别精密吸取供试品溶液，阴性样品溶液，红景天对照品溶液，酪醇对照品溶液各20 μL，依上述色谱条件进样测定，记录色谱图，结果红景天苷和酪醇均能得到较好的分离，阴性无干扰，理论塔板数以红景天苷计N＞3 000，以酪醇计 N＞2 000，见图 3。

图3 HPLC色谱图

3.1.3 溶液的制备

3.1.3.1 对照品溶液的制备 分别精密称取红景天苷、酪醇和二苯乙烯苷对照品3.21、18.00、1.62 mg，置10 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为 0.321、1.800、0.162 mg/mL的对照品溶液。

3.1.3.2 供试品溶液的制备 精密称取粉碎过筛的复方红景天口含片粉末约5 g，加8倍量60%乙醇回流提取2次，1.5 h/次，合并滤液，减压浓缩至干，残渣用甲醇超声溶解并定容至50 mL容量瓶中，作为供试品储备液，备用。精密量取供试品储备液10 mL，蒸干，用流动相溶解并定容至10 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

3.1.3.3 阴性样品溶液的制备 分别精密称量不含红景天药材的复方红景天口含片阴性样品各5 g，按“3.1.3.2”项下方法操作制得红景天阴性样品溶液。

3.1.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取浓度为0.321 mg/mL的红景天苷对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL于1 mL容量瓶中，流动相定容，分别进样20 μL，以峰面积为纵坐标，红景天苷含量(μg)为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y=2.84725e-0.007X-0.999435，r=0.999 7。结果表明：红景天苷在0.642～5.136 μg范围内呈良好的线性关系。分别精密吸取浓度为1.800 mg/mL的酪醇对照品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1.0mL于1 mL容量瓶中，流动相定容，分别进样20 μL，以峰面积为纵坐标，酪醇含量(μg)为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y=1.59549e-0.007X+0.0152195，r=0.999 1。结果表明酪醇在3.600～36.000 μg范围内呈良好的线性关系。

3.1.5 精密度试验 取已知浓度的红景天苷和酪醇对照品溶液，依上述色谱条件各连续进样6次，每次20 μL进行测定、计算，得红景天苷和酪醇浓度的RSD为1.27%和1.08%(n=6)，结果表明仪器精密度较好。

3.1.6 稳定性试验 取同一批号样品制得的供试品溶液，精密吸取 20 μL 分别于 0、2、4、6、8、10、12、24 小时，依“3.1.1”色谱条件进行测定，计算，得红景天苷和酪醇含量的RSD为2.29%和2.50%。结果表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

3.1.7 重复性试验 精密称取同一批号(2009091701)样品 6份，按“3.1.3.2”项下方法操作制得供试品溶液，分别精密吸取 20 μL，依“3.1.1”色谱条件进样测定，测得红景天苷和酪醇平均含量和 RSD值分别为 0.407%、0.0378%和1.74%、1.63%。

3.1.8 加样回收率 精密称取已知含量的复方红景天口含片(2009091702)粉末0.1 g，加入浓度为0.993 mg/mL的红景天苷对照品溶液及浓度为0.103 mg/mL的酪醇对照品溶液，按“3.1.3.2”项下方法操作制得供试品溶液，依上述色谱条件进样20 μL测定，计算，得红景天苷和酪醇的平均加样回收率和 RSD值分别为 100.29%、99.46%和1.69%、2.25%(n=6)，见表 1。

表1 加样回收率试验(n=9)

3.1.9 样品含量测定 精密称取粉碎过筛的复方红景天口含片粉末约5 g，按“3.1.3.2”项下操作制备供试品溶液，依法进样20 μL测定，计算。2批复方红景天口含片中，红景天苷的平均含量和RSD 值分别为 0.399%、0.402%和 2.44%、2.76%；酪醇的平均含量和RSD值分别为0.0375%、0.0372%和 1.54%、1.56%，结果见表 2。

表2 含量测定结果(n=3) %

3.2二苯乙烯苷含量测定

3.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5 μm)；预柱：ZORBAXSB-C18(4.6mm×12.5 mm)；流动相：乙腈 -水(15∶85)；流速：1.0 mL/min；检测波长：320 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。

3.2.2 对照品溶液的制备 精密称取二苯乙烯苷对照品1.62 mg，置10 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，配制成浓度为0.162 mg/mL的对照品溶液。

3.2.3 供试品溶液的制备 按“3.1.3.2”项下方法制得供试品溶液。

3.2.4 阴性对照品溶液的制备 精密称取不含制何首乌药材的复方红景天口含片样品约5 g，按“3.2.3”项下方法操作制备何首乌阴性对照品溶液。

3.2.5 系统适应性试验 分别精密吸取上述3种溶液各 20 μL，依“3.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，结果表明二苯乙烯苷可以得到较好的分离，阴性无干扰，理论塔板数以二苯乙烯苷计＞3 000。色谱图见图4。

图4 HPLC色谱图

3.2.6 标准曲线的绘制 分别精密吸取浓度为0.162 mg/mL的二苯乙烯苷对照品溶液50、100、200、300、400、500、600 μL 于 1 mL 容量瓶中，用流动相定容，分别进样20 μL测定，以峰面积为纵坐标，二苯乙烯苷的含量(μg)为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y=1.280 54e-008X+0.004 483，r=0.999 3。结果表明二苯乙烯苷在0.162～1.944μg范围内呈良好的线性关系。

3.2.7 精密度试验 取同一批号供试品溶液，依“3.2.1”项下色谱条件连续进样6次，每次20 μL进行测定，计算，测得二苯乙烯苷含量的RSD为0.94%(n=6)，结果表明仪器精密度较好。

3.2.8 稳定性试验 取同一批号供试品溶液于0，2，4，6，8，12，24 小时，分别精密吸取 20 μL，依“3.2.1”项下色谱条件，测得二苯乙烯苷含量的RSD为1.15%。结果表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

3.2.9 重复性试验 精密称取同一批号(2009091701)样品6份，按“3.2.3”项下方法操作制得供试品溶液，分别精密吸取20 μL，依“3.2.1”项下色谱条件进样测定，测得二苯乙烯苷的平均含量为0.051%，RSD 为 2.63%。

3.2.10 加样回收率 精密称取已知含量的复方红景天口含片(2009091702)粉末0.1 g，加入浓度为0.571 mg/mL的二苯乙烯苷对照品溶液，按“3.2.3”项下方法操作制备供试品溶液，依“3.2.1”项下色谱条件，进样20 μL测定，计算。二苯乙烯苷的平均加样回收率为100.34%，RSD为1.75%(n=9)，结果见表 3。

表3 加样回收率试验(n=9)

3.2.11 样品测定 精密称取粉碎过筛的复方红景天口含片粉末5 g，按“3.2.3”项下方法制备供试品溶液，依“3.2.1”项下色谱条件进行测定，计算，得两批复方红景天口含片样品中二苯乙烯苷的平均含量分别为0.051%、0.052%；RSD分别为2.63%、2.86%，结果见表 4。

表4 含量测定结果(n=6)

4 讨论

《中国药典》2010版(一部)红景天药材“鉴别及含量测定”项下仅收载了红景天苷的TLC及HPLC测定法，而无酪醇的测定，考虑到红景天苷及其苷元酪醇均为红景天的重要活性成分［2］，本试验建立了同时测定复方红景天口含片中红景天苷及其苷元酪醇的测定方法，该方法操作简便、可行，且重现性好，为含红景天药材的中药复方制剂的质量控制标准提供了参考。

本研究曾先后采用乙腈-0.02%磷酸、乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾、乙腈-2%甲醇、乙腈-水等流动相系统，结果发现乙腈-水(8.5∶91.5)作为流动相分离效果最佳，稳定性最好，图形最佳，故以此作为HPLC法的洗脱系统。