臭灵丹抗K562和NB4细胞作用及黄酮成分研究*

韦孝晨，严 彪，徐乃玉，李启润，张 健

苏州大学药学院，江苏 苏州 215123

臭灵丹Laggera pterodonta(DC.)Benth.为菊科六棱菊属植物，我国长江流域以及西南部地区均产，中国药典及云南药品标准均有收载；该药在民间应用广泛，具有抗菌、抗炎、镇痛、祛痰、抗肿瘤的作用，主要用于治疗上呼吸道感染、扁桃体炎、咽喉炎、口腔炎、支气管炎、痈肿疥疮等；臭灵丹的主要化学成分为洋艾素、金腰乙素等黄酮类、臭灵丹二醇、臭灵丹三醇等倍半萜类化合物［1］。本研究探讨臭灵丹乙醇提取物(CLD)及其大孔树脂95%乙醇洗脱部位(CLD-95)抗人白血病K562和NB4细胞的作用，以及乙醇提取物的黄酮类成分。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂Bruker AVⅢ-300、400型核磁共振仪；薄层层析硅胶和柱层析硅胶(200-300目，青岛海洋化工厂)；ODS柱色谱填料(Daisogel公司)；凝胶 SephadexTMLH-20(GE healthcare Bio-science AB，Up-psala Sweden)；HF151UV 细胞培养箱(HealForceDevelopmentLtd.)；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；XDS-1A型倒置式生物显微镜(上海精密仪器仪表有限公司)；StatFax-2100型酶联免疫检测仪(美国Awareness)；MH-2型微量振荡器(海门其林贝尔仪器制造有限公司)；KA-1000型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；SZ-93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；Thermo Labsystems型移液枪(美国赛默飞世尔公司)；XB-K-25型细胞计数板(沪 02270113)；9LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌锅(上海华线核子仪器有限公司)；RPMI1640(上海生物工程有限公司)；MTT(四甲基偶氮噻唑蓝，美国Sigma公司)；细胞培养瓶(美国Corning公司)；96孔平底培养板(美国Corning公司)；Thermo Scintific酶标仪(美国赛默飞世尔公司)；Beckman细胞计数器(美国贝克曼库尔特有限公司)。实验细胞株K562和NB4均购自上海细胞所；AB-8大孔树脂(河北沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；所有分离试剂均为分析纯，购于中国医药集团上海化学试剂公司。药材购于云南楚雄，经苏州大学药学院陆叶博士鉴定为臭灵丹全草。

1.2方法

1.2.1 化合物的提取分离 干燥臭灵丹全草500 g，用10倍量95%乙醇回流提取3次，2 h/次，提取液浓缩得乙醇提取物(CLD)119.5 g，溶于水中，石油醚萃取去除脂溶性杂质，得到水层45.0g，臭灵丹水层经AB-8大孔树脂依次用水，50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，分别得到70%乙醇洗脱部分 7.2 g、95%乙醇洗脱部分(CLD-95)5.3g；95%乙醇洗脱部分再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，用75%甲醇洗脱，洗脱成分经TLC检识合并，得 到 化 合 物 1，2，3，4；70% 乙 醇 洗 脱 部 分 经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱，洗脱成分经TLC检识合并，得到化合物5，6。

1.2.2 抑制K562和NB4细胞生长实验

1.2.2.1 MTT实验 取对数生长期K562和NB4细胞，调整细胞浓度至 1×104/mL，每孔 100 μL 种96孔板。RPMI 1640培养基稀释臭灵丹乙醇提取物(CLD)与大孔树脂95%乙醇洗脱部位(CLD-95)的储存液，使终浓度为 12.5、25、50、100、200 μg/mL，每孔加入体积为100 μL。每个浓度4复孔。设空白孔(无细胞)，阴性对照孔和不同浓度给药的细胞孔。培养24小时后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，继续培养4小时。1 200 r/min离心5分钟，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，摇床震荡10分钟，酶标仪测492 nm处吸光值。实验重复3次。细胞生长抑制率按以下公式计算：

1.2.2.2 FITC-Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡 取对数生长期的K562和NB4细胞，每孔2×105个，接种于 6 孔板，设空白孔(无细胞)，PI单染对照孔、Annexin-V单染对照孔和不同浓度药物处理孔。RPMI 1640培养基稀释臭灵丹黄酮部位储存液，使终浓度为 12.5、25、50、100、200 μg/mL，每孔终体积为1.5 mL，培养24小时，4℃离心，1 200 rpm×5 min，收集细胞，预冷 PBS 于 4℃，1 200 rpm×5分钟，洗涤1遍。每管加入100 μL 1×binding buffer、1 μLAnnexin-V FITC 抗体和1 μL PI，轻柔混匀，4℃避光静置20分钟。流式细胞仪检测，数据由Cell Quest软件分析处理。实验重复3次。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料以(±s)表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1化合物的结构鉴定

2.1.1 化合物1 黄色粉末，1H-NMR(400 MHz，CDCl3)中，δ12.60(1H，s，OH-5)，7.72(1H，dd，J=2.2，8.6Hz，H-6′)，7.67(1H，d，J=2.2Hz，H-2′)，6.98(1H，d，J=8.6 Hz，H-5′)，6.50(1H，s，H-8)，3.96(3H，s)，3.96(3H，s)，3.95(3H，s)，3.91(3H，s)，3.85(3H，s)。以上数据与文献［2］报道数据基本一致，故确定化合物为 5- 羟基 -3，6，7，3′，4′- 五甲氧基黄酮，即为洋艾素。

2.1.2 化合物2 黄色粉末，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6) 中 ，δ7.67(1H，s，H-2′)，7.63(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.96(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.68(1H，s，H-8)，3.92(3H，s)，3.88(3H，s)，3.81(3H，s)，3.74(3H，s)。以上数据与文献［2］报道基本一致，因此确定化合物为4′，5-二羟基-3，6，7，3′- 四甲氧基黄酮，即为金腰乙素。

2.1.3 化合物3 黄色粉末，1H-NMR(400MHz，CDCl3)中，δ 12.64(1H，s，OH-5)，7.71(1H，d，J=1.9 Hz，H-2′)，7.68(1H，dd，J=1.9，8.4Hz，H-6′)，7.05(1H，d，J=8.4Hz，H-5′)，6.45(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.36(1H，d，J=2.2Hz，H-6)，6.00(1H，s，H-3)，3.99(3H，s)，3.88(3H，s)，3.86(3H，s)。以上数据与文献［3］报道一致，因此确定化合物为 5- 羟基 -7，3′，4′- 三甲氧基黄酮。

2.1.4 化合物4 黄色粉末，在1H-NMR(400MHz，CDCl3) 中 ，δ12.61(1H，s，OH-5)，7.71(1H，dd，J=2.1，8.6Hz，H-6′)，7.67(1H，d，J=2.0Hz，H-2′)，6.97(1H，d，J=8.6 Hz，H-5′)，6.93(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.64(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，3.95(3H，s)，3.89(3H，s)，3.86(3H，s)，3.84(3H，s)。以上数据与文献［4］报道一致，因此确定化合物为雷杜辛黄酮醇。

2.1.5 化合物5 黄色粉末，1H-NMR(300 MHz，DMSO-d6) 中 ，δ 12.96(1H，s，OH-5)，7.86(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，6.85(2H，d，J=8.8Hz，H-3′，5′)，6.66(1H，s，H-3)，6.74(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.45(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.07(1H，d，J=7.2Hz glu H-1)，3.16-3.72(6H，m)，183.9(C-4)，165.2(C-2)，163.9(C-7)，162.3(C-5)，162.1(C-4′)，157.8(C-9)，129.5(C-2′，6′)，116.9(C-3′，5′)，122.0(C-1′)，106.3(C-10)，103.0(C-3)，99.5(C-6)，95.8(C-8)，100.8(glu C-1)，74.0(glu C-2)，77.1(glu C-3)，70.5(glu C-4)，77.3(glu C-5)，61.5(glu C-6)。以上数据与文献［5］报道基本一致，因此确定化合物为芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

2.1.6 化合物6 黄色粉末，1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：12.48(1H，s，OH-5)，7.67(1H，d，J=2.0Hz，H-2′)，7.52(1H，dd，J=8.4，2.0Hz，H-6′)，6.87(1H，d，J=8.4Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J=1.6Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=1.6Hz，H-6)；化合物的 1H-NMR 与文献［6］报道一致，故鉴定化合物6为槲皮素。

2.2对K 562和N B4细胞生长的抑制作用MTT法检测发现CLD和CLD-95对K562和NB4细胞均有生长抑制作用，提示CLD和CLD-95均能抑制K562和NB4细胞增殖，并且具有明显的浓度依赖关系。Annexin-V/PI双染法测定结果提示CLD-95的浓度从 12.5～200 μg/mL，K562细胞和 NB4的凋亡率呈增加趋势，表明CLD-95能诱导K562和NB4细胞的凋亡，并且有剂量依赖关系，随着浓度的增加，诱导作用随之增强，见图1—3。

图1 臭灵丹对K562和NB4细胞的抑制作用(n=5)

图2 Annexin V/PI法检测臭灵丹大孔树脂95%乙醇洗脱部位K562细胞凋亡情况(24 h)

图3 Annexin V/PI法检测臭灵丹大孔树脂95%乙醇洗脱部位NB4细胞凋亡情况(24 h)

3 讨论

相关文献［7］报道臭灵丹水煎液对急性淋巴细胞型白血病、急性粒细胞型白血病及急性单核细胞型白血病患者的血细胞脱氢酶有较强的抑制作用。臭灵丹中 3，5- 二羟基 -6，7，3′，4′- 四甲氧基黄酮(HTMF)显著抑制Hep-2细胞的增殖并呈浓度、时间双重依赖性关系［8］。MTT研究结果显示，臭灵丹的乙醇提取物与大孔树脂的95%乙醇洗脱部位均有抑制人白血病K562和NB4细胞的作用，大孔树脂的95%乙醇洗脱部位较乙醇提取物的活性强，推测大孔树脂95%乙醇洗脱部位可能是臭灵丹抗白血病的主要活性部位，其化学成分主要为黄酮类成分，并且从中分离得到4个黄酮苷元。Annexin V/PI双染流式细胞术检测法主要检测细胞的早期凋亡，大孔树脂95%乙醇洗脱部位作用24小时后，在一定浓度内，大孔树脂的95%乙醇洗脱部位通过诱导K562和NB4细胞凋亡而发挥抑制作用，并呈量效关系。本研究结果为进一步确定臭灵丹抗白血病药理机制及其活性成分奠定了基础。