日立F-7000荧光分光光度计的使用

(华南理工大学 化学与化工学院, 广东省功能分子工程重点实验室，广州 510640)

当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之消失，这种光线称之为荧光。荧光分光光度计具有灵敏度高、选择性强、取样量少、方法简便等优点。现已广泛应用于药物分析、农业、生命科学、环境科学、材料科学、食品科学等诸多领域[1-7]。日立F-7000荧光分光光度计具有如高灵敏度(信噪比为15000∶1)、高扫描速度(可达60000nm/min)等功能。本文简要介绍F-7000荧光分光光度计的工作原理和基本构造，同时以荧光增白剂33#(杀虫丹)为测试对象，对它的操作及维护进行详细介绍。荧光增白剂33#的化学名称乙硫甲威，分子式是C11H15NO2S，分子量:225.3073；CAS号:29973-13-5。分子结构式如图1所示。

图1 荧光增白剂33#结构式

1 主要原理和构造

1.1 荧光分光光度计工作原理

由光源(高压汞灯或氙灯)发出的紫外光和蓝紫光经单色器(滤光片)处理后特定波长的光照射到样品池中，激发样品中的荧光物质而发出荧光，荧光经过滤过和反射后，光信号被光电倍增管放大后，然后以图或数字的形式在控制软件上显示出来(图2)。

不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光化合物的该特征来进行物质的定性鉴定。

图2 荧光的产生F：荧光；P：磷光；A1，A2：吸收；ic：内转换；isc：系间串越；vr：振动松弛

1.2 荧光分光光度计构造

荧光光谱仪构造如图3所示，实物图如图4所示。

图3 荧光光谱仪构造图

图4 日立F-7000荧光分光光度计

(1)光源

为了便于选择激发光的波长，要求激发光源是能够在很宽的波长范围内发光的连续光源。在紫外-可见光区，荧光光谱仪的光源常用氙弧灯。高压泵灯是线性光源，可以发出313、365、405、436和546 nm的光，也是较常用的荧光光源。

(2)样品池

荧光仪用的样品池材料要求无荧光发射，通常用熔融石英，样品池的四壁均光洁透明。对固体样品，通常将样品用石英片固定于样品夹的底部表面，使之与入射光和出射光都成45°夹角放置。

(3)单色器

荧光分光光度计有两个单色器：激发单色器和发射单色器。单色器一般为光栅和干涉滤光片；滤光片可分为玻璃滤光片、胶膜滤光片和干涉滤光片3种。

(4)检测器

一般为光电管或光电倍增管检测器，二极管阵列检测器、电荷耦合器件阵列检测器(CCD)以及光子计数器等。

2 日立F-7000荧光分光光度计规格

日立F-7000荧光分光光度计的规格见表1。

表1 F-7000的规格

*1：激发波长为 350 nm, 狭缝 10 nm, 响应 4 s

*2：激发波长为 350 nm, 狭缝 5 nm, 响应 2 s

3 操作规程

3.1 开机

先开操作电脑，再开启主机电源(仪器主机左侧面板下方的黑色按钮(POWER))。同时，注意观察Xe LAMP和RUN指示灯(主机正面面板右侧)依次点亮，都显示绿色。

3.2 准备

(1)双击桌面FL Solution 2.1 for F-7000图标，待主机完成初始化后，自动进入扫描界面。

(2)初始化完成后，仪器须预热15～20分钟。

3.3 参数设置

Wavelength scan波长扫描模式(定性)：研究不同因素(浓度、温度等)环境对荧光物质荧光强度(或波长)的影响；

Time Scan时间扫描模式：测定荧光物质的荧光强度随时间的变化；

Photometry光度计法模式(定量)：光度测定，定量实验；

3-D Scan 3D扫描模式：确定未知荧光物质的最适激发波长和发射波长。

实验室常用为Wavelength scan 和3-D Scan。

3.3. 1 Wavelength scan参数设置

Wavelength scan参数设置见图5。

图5 Wavelength scan参数设置

主要参数选项包括：

①选择扫描模式“Scan Mode”：发射光谱、激发光谱和同步荧光；

②选择数据模式“Data Mode”：荧光测量、磷光测量、化学发光；

③设定波长扫描范围

A、扫描荧光激发光谱(Excitation)：设置最适激发波长；

B、扫描荧光发射光谱(Emission)：设置发射波长范围(包含最适发射波长)；

注意：激发光终止与发射光起始波长差应不小于10nm。

④选择仪器响应时间“Response”(一般选Auto)；

⑤在光闸控制“□Shutter Control”选项打√，以确保仪器开启后关闸自动打开，参数设置好后，点击“确定”即可。

3.3.2 3-D Scan参数设置

Wavelength scan参数设置见图6。

图6 3-D Scan参数设置

3.4 数据处理

打开测试文件，右键单击出现界面：选择Properties，在Output选择Use Microsoft Excel，将Include data list 和Include peak table前面打勾，设置输出数据起始和终止波长，点击确定。在菜单栏点击Data，选择Report，将数据输出至excel，然后将数据文件复制到origin里作图。

3.5 关机

(1)关闭运行软件FL Solution 2.1 for F-7000；

(2)选中“Close the lamp，then close the monitor windows”，点击“Yes”。窗口自动关闭。同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP指示灯暗下来，而RUN指示灯仍显示绿色(目的是仅让风扇工作，使氙灯室散热)；

(3)散热约20分钟后，关闭仪器主机电源。

4 日常维护

(1) 氙灯在使用时不宜频繁开关，氙灯关闭，需要重新开启前，请确保氙灯完全冷却后再开启，以免缩短其寿命。仪器开启后，如果超过两个小时不用仪器，就关掉氙灯。荧光氙灯的寿命在500小时左右。

(2)每次做完实验后，应先在软件上操作关闭氙灯，等仪器(氙灯)散热完后再关仪器，再关闭电脑。

(3)使用时参数设定应按照操作规定，尽量避免倍频峰的出现，减小光电倍增管损耗。

5 操作实例

5.1 水溶液中荧光增白剂33#的荧光测定

(1)称取2.3 mg 增白剂33#，放入10 mL容量瓶中，配成浓度为1.0 ×10-3M的水溶液。从上述溶液中取出0.5 mL，置入50 mL容量瓶中，定容，配成浓度为1.0 x 10-5M的荧光增白剂水溶液。待用。

(2)设置荧光分光光度计参数，电压700，狭缝1×5，激发波长先选为342 nm(初始设定，后续再精确选择激发波长)，扫描波长范围设为360 nm ～ 670 nm(扫描初始波长应比激发波长大10～20 nm，扫描结束波长应小于激发波长的两倍，以避免仪器的倍频峰)。

(3)将配好的浓度为1.0 × 10-5M的荧光增白剂水溶液取少许倒入四面光石英比色皿中(10× 10× 45 mm)，先用342 nm激发波长激发，点“Measure”开始扫描，得到如图7所示荧光发射光谱图。荧光发射的最高峰为430 nm左右。

图7 荧光增白剂33#发射光谱(激发波长为342 nm)

(4)精确选择待测样品的激发波长。点击“Method”按钮，将荧光分光光度计设为“激发扫描”，固定最大发射波长为430 nm，扫描范围为255 nm ～ 420 nm(扫描结束波长应小于设定的激发波长)。扫描得到以下光谱(图8)。

(5)选图8中最高峰波长为激发波长，即347 nm。点“Method”，重新设定仪器为发射光谱，扫描范围为360 nm ～ 650 nm，其余保持不变。其发射光谱图如图9所示。因为初始假定激发波长与后选定激发波长相差不多，所以发射光谱变化不大。以266 nm为激发波长，得到的发射光谱如图10所示。

图8 荧光增白剂33#激发光谱(发射波长为430 nm)

图9 荧光增白剂33#发射光谱(激发波长为347 nm)

图10 荧光增白剂33#发射光谱(激发波长为266 nm)

可以看出，在同等条件下，用激发波长(266 nm)的荧光强度只有40左右，而用合适的激发波长(347 nm)激发，增白剂33#荧光强度有3500左右。可见，在荧光测试中，选择合适的激发波长十分关键。

5.2 固体荧光增白剂33#的荧光测定

(1) 选择固体荧光夹具，用小药勺取适量荧光增白剂33#粉末至于夹具槽中，用小玻璃片压实，用螺丝夹在45°角夹具上，待用。

(2)寻找样品发射光谱最高峰波长。点“Method”，将参数中电压降为400，其余参数先不改动，用液体样品激发波长(347 nm)激发，得到如图11所示发射光谱。从图中可观察到荧光发射光谱最高峰波长为446 nm， 且图谱相比较液体状态下更“尖锐”。

图11 固体荧光增白剂33#发射光谱图(激发波长为347nm)

(3)精确选择待测样品的激发波长。点击“Method”按钮，将荧光分光光度计设为“激发扫描”，固定最大发射波长为446 nm，扫描范围为230 nm ～ 425 nm(扫描结束波长应小于设定的激发波长)。扫描得到如图12所示激发光谱图。

图12 固体荧光增白剂33#激发光谱图(发射波长为446nm)

(4)从图12中可以看出，最高峰波长为激发波长为277 nm。点“Method”，重新设定仪器为发射光谱，扫描范围为297 nm ～ 540 nm，其余保持不变。得到如图13所示发射光谱图。

图13 固体荧光增白剂33#发射光谱图(激发波长为277 nm)

从图13中可以发现，用277 nm激发，样品荧光强度为2700左右，而用347 nm激发，荧光强度只有1700。这也证明了，同一物质，在溶液状态下和固体状态下表现出的荧光性质可能不完全相同。

6 结语

由于荧光特性对于微环境的敏感化，荧光分析法已经广泛用于表征所研究的物理、化学性质及其变化。使得科研工作者进行工业材料、生命科技、生物技术等领域的研究变得更加便利。同时，了解仪器的工作原理和构造是本科生、研究生能够熟练的应用仪器的前提，而且对仪器的操作规程的熟练也是实验成功的关键。合理有效的维护与保养，有利于提高仪器的使用率，并且降低设备维护成本。