毛细管电泳的离子富集性能研究

2018-08-14

分析仪器 2018年4期

(北京普析通用仪器有限责任公司,北京 101200)

在分析化学研究领域，近年来毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE) 是发展较快的技术。近些年在一些重大国际研究项目中发挥了关键的作用[1]。毛细管电泳作为芯片实验室[2]最重要的基础技术之一，在DNA与RNA分析、环境监测、食品安全、药物分析等方面都有大量应用[3]。

毛细管电泳分析金属离子简单快速[4，5]，自20世纪末以来,毛细管电泳被广泛的应用于无机离子和其他低分子量离子的测定。由于一般的金属离子不具有光学活性，对于金属离子测定,多采用间接紫外检测法，或者利用毛细管柱上浓缩技术，通过增加上样量以提高检测灵敏度。场增强进样、电堆积富集及等速电泳等多种模式都属于柱上浓缩技术。电堆积富集利用样品区带与载体电解质的电阻率不同，使得样品离子堆积富集在样品区带与运行区带边界处。金属离子的测定也可以利用X射线荧光, 可以先进行离子富集, 再进行测定。

在线富集是提高毛细管电泳灵敏度的一种有效手段，由于对仪器要求低和操作简单得到了快速发展。由于单一富集的方法往往有一定的局限性，为了提高毛细管电泳的灵敏度，可将两种或多种富集方法联用。毛细管电泳在线富集方法研究的另一主要方向是将在线富集方法与高灵敏度检测技术相结合。对复杂基质中痕量及超痕量组分的富集是建立新富集方法的重点。新富集方法需要兼顾重现性高、无需离线预处理、富集时间短和操作简单等要求。由于在线富集技术在不断的发展，今后毛细管电泳的检测灵敏度会有显著的提高。毛细管电泳在蛋白质组学[6,7]、环境和食品科学等分析领域将发挥更大的作用。检测手段的提高也进一步拓展了毛细管电泳的应用领域，像CE-MS联用不仅分离效率高，且能提供结构信息，在疾病的诊治[8]及肿瘤的研究中[9]都是重要工具。

目前，从事毛细管电泳技术与应用相关研究的科研院所、院校均配备商业化毛细管电泳仪，许多有条件的科研单位均选择灵敏度更高的荧光检测系统和全自动化进样系统。目前分析仪器市场上性能突出的毛细管电泳仪基本为进口仪器(如Agilent、Beckman等)，由于价格昂贵，限制了其进入更多的实验室。因此开发高性能、低成本、具有自主知识产权的国产毛细管电泳仪器既能满足相关领域更为广泛的技术应用需求、也能填补国内分析仪器在中高端产品的市场空白。

1 原理

1.1 毛细管区带电泳

电泳是指电解质溶液在电场作用下，其中的带不同电荷的粒子会以不同的速度朝与其所带电荷相反的电场方向进行迁移的现象。一般情况下毛细管电泳使用石英材料毛细管，当石英毛细管在PH>3时，毛细管的内表面会带负电，而在与其接触的溶液表面上则会形成一大小相等符号相反的电荷层,于是一双电层存在于溶液与管壁的界面上。当毛细管两端施加一个高电压时，双电层中的水合阳离子层会驱动溶液整体在毛细管内向负极流动，这个溶液的整体流动称为电渗流。电解质溶液中的带电粒子的电泳和电渗流的矢量就是离子在毛细管内的迁移速度。带电粒子在毛细管中的迁移过程中，带正电荷粒子的电泳速度和电渗流速度方向相同，在各种粒子中最先流出。中性粒子不受电泳的影响，迁移速度就是电渗流的速度。由于负电性粒子的电泳方向与电渗流的方向相反，运动速度是电渗流与电泳速度之差(一般情况下电渗流速度大于电泳速度)，因此在毛细管电泳中带负电荷的粒子是最后流出。不同种类的粒子的分离就是利用了不同离子在毛细管电泳中的迁移速度不同而实现的，利用这种分离原理的方法称为毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis，CZE)。区带电泳是毛细管电泳的最常用形式，仪器装置的组成主要包括毛细管、高压电源、柱上检测器和缓冲液贮瓶，两个缓冲液贮瓶分别在毛细管的两端且与高压电源相连，常用电压一般在数千伏至数十万伏，温度在25℃左右，检测器以紫外检测器为主。

1.2 等速电泳

等速电泳是基于离子淌度差异的一种电泳富集模型，又被称为“移动边界”电泳技术。其样品在前导和尾随电解质之间被注入。在高电压的作用下各组分会逐渐分离，随着组分的分离各组分区带的电场也在发生着相应的变化。电导较大的离子电泳迁移速率也较大，但区带的电场反而较小，其迁移速率就会逐渐降低。当各组分的电泳迁移速率均达到前导电解质的迁移速率相同时达到平衡状态，此时溶液出现稳态迁移模式。等速电泳的负载量进样量比毛细管区带电泳高很多，可达μL级。等速电泳对痕量样品起到很好的浓缩作用，是一种理想的样品富集技术。等速电泳非常适用于血样、尿样以及环境样品等复杂样品基质的生物样品体系，应用范围包括荷电小分子和蛋白质等生物大分子。

1.3 色谱富集

固相萃取富集是一种离线样品前处理方法，在毛细管电泳分离中经常使用。该方法是毛细管电泳在线富集的一种新手段，实际上就是在毛细管柱上进行色谱富集。其富集的过程是先将量比较大的低浓度样品负载到固定相中，再用体积相对较小的洗脱液将样品洗脱下来，从而得到浓度较高的富集溶液。在分析工作中常见的与毛细管在线联用的方法有固相萃取、膜萃取和液相萃取等。但色谱富集方法的缺点是操作时间过长、自动化程度低。

1.4 样品堆积

在高电压的作用下，若毛细管中同时存在着低导和高导溶液时,低导溶液区的电场要比高导溶液区的电场强度高，低导区的样品离子迁移速度要比高导区的样品离子迁移速度快。样品堆积技术就是利用了这个速度的差别。该方法先将待测样品溶解于低导溶液中，在高电压作用下毛细管中的样品离子向高导的缓冲溶液中运行。样品离子在越过低导溶液和高导缓冲液交界面时，迁移速度会大幅度的降低,样品离子速度骤降的结果导致了样品区带长度的缩短，浓度则相应提高，从而达到富集目的。

毛细管电泳在线富集方法中样品堆积方法是应用较为广泛的方法之一，现已经广泛应用于阴、阳离子和混合离子的分离分析。目前主要有压力进样和电动进样两种样品堆积方法。采用电动进样的样品堆积又被称为场放大进样，电动进样是一种更高效的在线富集方法，具有比压力进样更高的浓度检测灵敏度。

1.5 pH法

常见的pH法有pH调制堆积和动态pH联接。pH调制堆积中的酸富集是将样品用高离子强度的溶液制备并通过电迁移引入毛细管，然后通过电迁移引入一小段强酸溶液。强酸中的质子在电动进样时快速地向样品区带迁移，中和了其中的弱酸根离子，使待测组分变为电中性，导致电中性样品区带的电导率大大降低，使得待测组分在样品区带与背景缓冲溶液的界面处进行堆积，样品区带缩短，样品浓度增加，从而使灵敏度显著提高，可以用于高盐基质中痕组分的分析。但毛细管大部分长度用于富集了，用于分离的长度仅占一小部分，会严重影响方法的分离能力。该法对于复杂组分样品的测试不利，但非常适合组分简单的样品中的痕量组分分析。

1.6 络合平衡富集法

金属离子在进入流动相时，会与其中的络合剂发生络合使离子的迁移状态发生骤变而实现离子的富集[10]。在样品区带前端样品溶液中的金属离子迁移到初始样品区段与运行区段的边沿时，与流动相中的络合剂络合，原来带正电的离子变为中性或带负电，电泳迁移速率会明显降低或改变迁移方向；而样品区带后端的带正电荷金属离子继续迁移，在遇到带负电荷的络合剂离子后发生络合反应，在两相界面堆积从而达到富集的目的。

2 试验

2.1 试验器材

毛细管电泳仪：型号Beckman P/ACE System 5010，生产商：美国Beckman公司；熔融石英毛细管50μm，生产商：河北永年光导纤维厂。咪唑(分析纯);α-羟基乙酸(分析纯);其他有关试剂均为分析纯。

2.2 仪器测验条件

紫外检测波长：214nm；试验温度：25℃；电泳电压：20kV；采集频率：16Hz。

毛细管使用前以1mol/L NaOH溶液、纯净水、缓冲液分别依次冲洗3min。

清洗液：0.1mol/LHCl溶液；0.1mol/LNaOH溶液；纯净水；背景电解质：咪唑溶液(10mmol/L)， α-羟基乙酸(10mmol/L)；pH=4.0。

3 结果与讨论

使用毛细管区带电泳法对食品中常见的一些指标元素进行了探索分析, 发现背景电解质和缓冲液pH值对离子间的分离影响较大。咪唑浓度的增加与离子分离效果成正比，但增强的背景吸收会掩盖离子峰的强度，如果咪唑浓度过高会影响方法的灵敏度。pH值明显影响配位平衡，pH值的增加会导致各离子峰的区分度变差，主要原因是pH值的增加增大了电渗流。增大α-羟基乙酸浓度会增加各离子峰的迁移时间，但太低的浓度不利于各离子峰的区分。实验条件需要针对具体情况综合优化，综合优化条件下3种食品中作为重要指标元素的金属离子的毛细管电泳结果见图1。