LXA4、TNF-及其比值与子痫前期发生发展的相关性研究

王 莉，丁依玲

(1.海南省人民医院产科，海南 海口 570000；2.中南大学湘雅二院产科，湖南 长沙 410000)

子痫前期(preeclampsia，PE)的发生发展，特别是子痫的发生可以导致患者病死率的上升，并促进最终不良临床结局的发生。流行病学研究显示PE的发病率可达0.6%～1.8%，特别是在部分地区的人群中的发病率更高[1]。在探讨PE发病机制的过程中发现，细胞炎症因子等生物学因子激活导致的氧化应激障碍或者代谢性损伤等，均可以促进PE患者的病情进展。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-)等，可以通过激活下游炎症因子IL-6等的上调，促进胎盘血管内皮的损伤，加剧胎盘血管的螺旋化等重塑性障碍，导致血流动力学紊乱[2-4]。为了进一步揭示LXA4、TNF-在PE发病机制过程中的作用，本研究选取PE产妇78例，探讨相关指标在胎盘及血清中的异常表达，报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年2月至2017年2月在海南省人民医院分娩的PE产妇78例，其中轻度PE产妇45例(轻度PE组)，重度PE产妇33例(重度PE组)，纳入标准：①诊断符合谢幸等主编的《妇产科学》(第8版)标准；②自愿提供胎盘组织；③单胎妊娠初产妇；④产妇及家属知情同意并签署同意书。排除标准：①合并胎膜早破、前置胎盘等产科其他合并症；②有糖尿病、甲状腺功能亢进、血液系统疾病等；③近1个月内服用过抗炎药物或免疫抑制类药物。同时选取正常产妇50例作为对照组，对照组、轻度PE组和重度PE组产妇年龄、孕周、孕次等一般资料差异无统计学意义，见表1。

组别例数(n)年龄(岁)孕周(周)孕次(次)对照组5026.03±3.4138.21±2.061.24±0.41轻度PE组4525.94±2.8038.04±1.971.20±0.24重度PE组3326.06±3.0438.17±2.161.31±0.34F1.0672.0441.874P>0.05>0.05>0.05

1.2酶联免疫吸附测定

采取两组患者静脉血用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测LXA4、TNF-水平，采用低温高速离心机进行离心，1 000r/min(离心半径为15cm)，获得血清后抽取50μL样品加入96孔板内，采用去离子水作为阴性对照，采用50μL磷酸盐缓冲液作为阳性对照，平衡摇晃20s混匀，室温下孵育2h，采用磷酸二钠缓冲液(TBST)清洗3次，每次5min，加入100μL底物，平衡摇晃30～45s，25℃室温下孵育40min，加入250μL终止物，直到96孔板中每孔的颜色变黄，最后以空白对照为基准，采用分光光度计进行读数。LXA4、TNF-抗体购自罗氏检测公司，相关配套试剂购自南京凯基生物科技有限公司，严格按照说明书的要求进行操作。

1.3免疫组化检测

采用石蜡切片脱蜡至水，切片厚度3mm，3%H2O2室温孵育5min，采用去离子水冲洗3次，每次3min，采用浓度为10%牛奶蛋白(1g蛋白加入100mL纯水)封闭，室温孵育5min，加入LXA4受体和TNF-抗体(鼠来源，南京碧云天生物科技有限公司)，37℃孵育2h，PBS缓冲液冲洗3次，每次5min，滴加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗(兔来源，购自罗氏检测公司)，37℃孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min，加入溴甲酚紫指示剂，显色5min，复染，脱水，透明，封片，镜下观察。OLIPICS电子显微镜购自上海精密仪器有限公司，配套试剂购自南京泰康生物科技有限公司。

1.4结果判断

采用Fromowitz综合计分法，蛋白阳性表达位于细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒。随机选取5个高倍镜视野，计数滋养细胞总数及阳性细胞总数，根据阳性细胞比例计分，比例<25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度为无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；总分=染色强度得分×细胞比例得分，>2分为阳性，≤2分为阴性。

1.5统计学方法

2结果

2.1各组胎盘组织LXA4受体和TNF-表达

轻度PE组和重度PE组LXA4受体蛋白阳性表达率分别为55.55%和60.61%，明显低于对照组，差异均有统计学意义(χ2值分别为19.077、14.246，均P<0.05)，而TNF-蛋白阳性表达率分别为80.00%和81.82%，明显高于对照组，差异均有统计学意义(χ2值分别为25.688、23.035，均P<0.05)，见表2和图1。

表2各组胎盘组织LXA4受体和TNF-表达[n(%)]

Table 2 Expressions of LXA4 receptor and TNF-in placenta in each group[n(%)]

Table 2 Expressions of LXA4 receptor and TNF-in placenta in each group[n(%)]

组别例数(n)LXA4受体蛋白阳性表达TNF-α蛋白阳性表达对照组5047(94.00)14(28.00)轻度PE组4525(55.55)a36(80.00)a重度PE组3320(60.61)a27(81.82)aχ220.10935.424P<0.05<0.05

注：a与对照组比较P<0.05。

注：A和D为对照组LXA4受体和TNF-表达；B和E为轻度PE组LXA4受体和TNF-表达；C和F为重度PE组LXA4受体和TNF-表达。

图1免疫组化图

Fig.1 Immunohistochemistry image

2.2各组血清LXA4、TNF-比较

轻度PE组血清LXA4明显高于对照组和重度PE组，差异均有统计学意义(t值分别为12.163、10.476，均P<0.05)；轻度PE组和重度PE组TNF-明显高于对照组，差异均有统计学意义(t值分别为48.500、37.304，均P<0.05)；重度PE组LXA4/TNF-明显低于对照组和轻度PE组，差异均有统计学意义(t值分别为25.271、16.106，均P<0.05)；轻度PE组LXA4/TNF-明显低于对照组，差异有统计学意义(t=16.970，P<0.05)，见表3。

2.3相关性分析

表3各组血清LXA4、TNF-比较

Table 3 Comparison of serum LXA4 and TNF-

Table 3 Comparison of serum LXA4 and TNF-

注：a与对照组比较P<0.05；b与重度PE组比较P<0.05。

3讨论

3.1子痫前期的背景相关研究

饮食习惯的改变、遗传易感因素及高脂血症等，均可以促进子痫前期的发生发展，特别是在具有高血压家族史的患者中，子痫前期的发病率可较普通对照人群上升3～4倍[5]。子痫前期的长期发展，可以导致孕产妇妊娠中晚期发生胎盘早剥、产后出血及产褥期并发症的发生，临床预后不佳。解痉、降压、肝素抗凝等综合性治疗，虽然可以在一定程度上抑制病情的进展，但治疗的总有效率不足35%，患者的病情进展率仍然可达40%以上。而对于子痫前期发病过程中的相关机制的探讨，可以为疾病的生物学治疗提供理论基础，从而提高子痫前期的治疗效果。

3.2 LXA4及TNF-α的异常表达与子痫前期发病的潜在关系

LXA4可以通过增加胎盘血管内皮细胞的氧化损伤，促进绒毛膜滋养细胞凋亡和蜕膜组织的退行性病变，进而导致子痫前期的发生发展。特别是对于胎盘血管的螺旋化、弓状血管的重塑等生理过程的影响，可以导致胎盘血管的血流灌注阻力的增加，促进病情的进展[6-7]。TNF-作为细胞炎症因子，其可以通过激活下游单核细胞、巨噬细胞等的上调，促进炎症细胞对于胎盘组织的浸润[8-10]，加剧了胎盘血管的螺旋化病理改变、促进血流动力学障碍，血流呈现出明显的高阻力、低灌注表现，从而影响血压波动[11-12]。已有的研究探讨了LXA4及TNF-的异常表达，但多数研究局限于血清学资料的对比研究，缺乏对胎盘组织中相关蛋白水平的表达研究。

3.3 LXA4及TNF-α的异常表达在促进子痫前期患者病情进展过程中的作用

本研究发现，在胎盘组织中，LXA4受体的阳性表达水平较低，低于正常对照组人群，差异具有统计学意义，提示LXA4受体的异常表达可能促进了子痫前期患者的病情进展，LXA4受体数量或者敏感性的改变，可以通过影响胎盘组织的氧化应激障碍、促进炎症反应等，进而导致血压的波动，促进肾脏等多器官的损伤；在胎盘组织中，可发现TNF-蛋白的阳性表达率较高，高于正常对照人群，TNF-的高表达可以通过激活下游IL-6或IL-10等，加剧局部线粒体能量利用障碍，促进胎盘微血管的损伤。王素梅等[13]和张俊农等[14]在探讨重度子痫前期患者的发病机制的过程中发现，TNF-等的激活是促进PE患者病情进展的持续性核心因素，其中胎盘组织中TNF-的表达阳性率可平均上升25%以上，患者的血压控制效果越差、病情越严重，相关指标的表达越高。在探讨血清学相关指标的改变过程中发现，轻度和重度PE组TNF-明显高于对照组，TNF-在胎盘组织或者血清中均呈现出明显的高表达趋势，提示TNF-的表达能够显著促进患者病情的进展，这主要由于TNF-的表达提高了血管内皮的损伤程度，进一步导致血管的痉挛和血压的上升[12]。但本研究并未发现LXA4在血清中表现出同样的低表达趋势，结果显示轻度PE组血清LXA4明显高于对照组和重度PE组，差异具有统计学意义，考虑可能与LXA4的受体敏感性或正反馈调控障碍等有关，也可能与本研究的样本量较少有关。LXA4/TNF-可以有效评估患者的病情，重度组患者的LXA4/TNF-明显低于轻度组，而轻度组LXA4/TNF-也明显低于正常对照组。相关关系分析也发现，LXA4与TNF-具有密切的关系，同时LXA4/TNF-与PE患者病情呈负相关，患者的病情越严重，LXA4/TNF-的指标越低。

3.4总结

本研究的创新性在于探讨了LXA4受体水平的表达异常，同时揭示了胎盘组织中LXA4等因子的表达变化，相关关系分析也可以进一步揭示不同炎症因子的致病机制。综上所述，PE患者血清LXA4和TNF-，以及胎盘组织LXA4受体和TNF-表达异常，可能与疾病的发生发展有关，其中LXA4/TNF-比值可在一定程度上反映病情程度。