酶法水解玉米浆制备玉米肽的研究

马雪，李杨，王成法，张金凤

(1.绥化学院 食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061；2.黑龙江龙凤玉米开发有限公司，黑龙江 绥化 152000)

我国是真正的玉米淀粉生产大国，目前国内都是采用湿法来制备淀粉，市面上80%以上的淀粉都是以玉米为原料生产的[1]。每年生产玉米淀粉的同时也会有大量的玉米浸泡液产出，玉米浸泡浓缩液也称玉米浆，是玉米湿法加工生产淀粉时的一种主要副产物。玉米浆中蛋白质含量很高[2]，在实际应用中通常采用喷雾干燥的方法制成干粉加到饲料中，或者直接作为“三废”处理和排放掉[3]，若能对玉米浆中的蛋白质成分进一步开发利用，可大大提高玉米加工企业的经济效益。

利用酶法对玉米蛋白进行水解生产玉米肽具有高安全性、高效性等特点[4,5]，而且，对玉米肽进行的研究表明：与玉米蛋白相比，玉米肽具有良好的溶解性，能够在较大pH范围内完全溶于水，无浑浊、沉淀现象[6]，具有高浓度、低粘度等功能特性，可应用于开发复合调味汁或高蛋白流体食品；还具有易消化吸收、促进微生物发酵、抗氧化活性等特性，可以作为生产酱油、酸奶、发酵火腿等发酵食品的添加剂；另外，还可以利用其抗疲劳、促进乙醇代谢等活性[7]，开发成运动饮料、醒酒饮料等功能饮料。所以，玉米肽可以被广泛地用作保健食品、发酵调味食品及其他原料。酶水解法是目前生产活性肽的主要方法[8],是一种不完全的水解，因为蛋白质酶水解后并不是生成单个的氨基酸，它的产物是多肽。水解反应并没有如钠和水反应那样剧烈，非常温和地进行，而且反应很快、效率非常高，因为产物是多肽，所以原有的氨基酸没有任何变化，此法制多肽不需要投入太大的人力、物力，只需将酶与底物混合好、控制好反应条件即可，而且反应水解很彻底，几乎没有残留，杂质也很少。

本研究利用酶法对玉米浆进行水解制备多肽，通过不同的酶种类、温度、时间、酶与底物比、pH值等单因素试验和正交试验确定最佳酶解工艺，研究结果对提高玉米浆蛋白的利用价值和开发具有生理活性的玉米肽产品具有实际指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米浆(黑龙江龙凤玉米有限公司提供)；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶(北京奥博星生物技术有限公司)；中性蛋白酶(武汉金科天成科技有限公司)；氨基乙酸、水合茚三酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、D-果糖、硼酸、氢氧化钠、乙醇(均为分析纯)；盐酸(优级纯)。

1.2 仪器设备

PHBJ-260型便携式pH计 合肥卓尔仪器仪表有限公司；HH-S4电热恒温水浴锅 金坛市岸头国瑞实验仪器厂；离心机 湖南星科科学仪器有限公司；PL203型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；SH220石墨消解仪、K9840自动凯氏定氮仪 济南海力仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

玉米浆需要加热破坏玉米蛋白的稳定结构使其可以被蛋白酶水解。而且试验材料是湿法制玉米淀粉的副产物玉米浆，里面含有其他酶类。因此，本试验采用热处理即沸水浴30 min使玉米浆蛋白变性并且使其他杂酶失活，避免其影响试验。

1.3.2 原料中蛋白质的含量测定

利用凯氏定氮法测定原料中蛋白质的含量。主要目的是确定试验不同酶与底物比时酶的用量。

1.3.3 蛋白质水解度的测定[9]

用甘氨酸做标准氨基酸并配制合适浓度梯度的标准溶液，同时做空白试验，在分光光度计570 nm处测定吸光度A值。以甘氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。取水解后的样品液0.1 mL于100 mL容量瓶中并且定容，然后从容量瓶中取0.40 mL试液于具塞比色管中，然后加入1.0 mL指示剂和1.6 mL蒸馏水，混匀，加热灭酶，冷却后加入5 mL的40%乙醇溶液，混匀后放置15 min，同时做空白试验，于570 nm处测定A值，利用标准曲线可知水解液中-NH2基的含量。

水解度：DH(%)=h/htot×100%=(水解液中-NH2基的含量-水解前-NH2基的含量)×100%/htot。

式中：h为每1 g水解物中被裂解的肽键毫摩尔数(mmol/g protein)；htot为每1 g原料蛋白质中总的肽键毫摩尔数(mmol/g protein)，玉米蛋白的htot为9.2。

1.3.4 不同酶对玉米浆蛋白水解度影响的研究

称取经预处理的玉米浆4份，每份15 g，蛋白质质量分数均为32%，按酶与底物比3%(W/W，底物重量按蛋白质质量计)的添加量依次添加碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶，调节pH、温度至各种酶理论最适值，酶解4 h后，加热灭酶10 min，于3000 r/min离心10 min，然后按1.3.3中样品检测方法操作，测定吸光度值A，计算水解度。选出水解度最高的酶作为试验用酶。

1.3.5 中性蛋白酶水解条件的确定

1.3.5.1 pH对水解度的影响

称取经预处理的玉米浆5份，每份15 g，蛋白质质量分数均为32%，分别加入中性蛋白酶3%(W/W，底物重量按蛋白质质量计)，5份玉米浆pH值在6.5～8.5之间平均相差0.5，在50 ℃下反应4 h后，加热灭酶10 min，于3000 r/min离心10 min，然后按1.3.3中样品检测方法操作，测定吸光度值A，计算水解度。

1.3.5.2 酶与底物比对水解度的影响

称取经预处理的玉米浆5份，每份15 g，蛋白质质量分数均为32%，5份样品按酶与底物比(E/S)从1.5%开始递增至4.0%，相邻样品差值为0.5%加入中性蛋白酶，并用NaOH溶液把玉米浆pH调节到7.5，在50 ℃下反应4 h后，加热灭酶10 min，于3000 r/min离心10 min，然后按1.3.3中样品检测方法操作，测定吸光度值A，计算水解度。

1.3.5.3 时间对水解度的影响

称取经预处理的玉米浆5份，每份15 g，蛋白质质量分数均为32%，分别加入中性蛋白酶3%(W/W，底物重量按蛋白质质量计)，调整玉米浆pH值至7.5，在50 ℃下水解，5份样品反应时间在2～6 h之间，每隔1 h取1个样品加热灭酶10 min，于3000 r/min离心10 min，然后按1.3.3中样品检测方法操作，测定吸光度值A，计算水解度。

1.3.5.4 温度对水解度的影响

称取经预处理的玉米浆5份，每份15 g，蛋白质质量分数均为32%，分别加入中性蛋白酶3%(W/W，底物重量按蛋白质质量计)，并用NaOH溶液把玉米浆pH调节到7.5，5份溶液的水解温度分别在40～60 ℃之间平均相差5 ℃，反应4 h后加热灭酶10 min，于3000 r/min离心10 min，然后按1.3.3中样品检测方法操作，测定吸光度值A，计算水解度。

1.3.6 正交试验设计

选取单因素试验结果分析中的显著因素，采用L9(34)正交试验设计，确定最佳酶解条件，试验因素水平表见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 不同酶对玉米浆蛋白水解度影响的研究

通过对4种不同酶的水解度进行测定，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶对玉米浆蛋白的水解度分别为28.67%，36.17%，24.12%，18.43%。由水解度结果可知，中性蛋白酶的水解度最高，最终选择中性蛋白酶作为制备玉米肽的水解酶。

2.2 中性蛋白酶水解条件的确定

2.2.1 pH对玉米浆蛋白水解度的影响

pH对玉米浆蛋白水解度的影响结果见图1。

图1 pH对玉米浆蛋白水解度的影响

由图1可知，水解度达到最大值41.7%时溶液pH为7.5。在pH超过7.5后水解度一直在减少，由此可知所用蛋白酶的活力最高pH值为7.5，pH值大于或者小于7.5都会影响到中性蛋白酶的活力，从而影响到中性蛋白酶对玉米浆的水解效果。

2.2.2 酶与底物比对玉米浆蛋白水解度的影响

酶与底物比对玉米浆蛋白水解度的影响结果见图2。

图2 酶与底物比对玉米浆蛋白水解度的影响

由图2可知，酶与底物比为1.5%时水解度最低，之后水解度开始增加，而且其水解度达到较大的峰值32.4%时酶与底物比为3.0%，当酶与底物比大于3%时，随着酶与底物比进一步提高，其水解度上升趋势非常小甚至不再增加。因为当酶与底物比较低时，酶与所有底物结合，反应速度随着酶与底物比的升高而增加，酶与底物比较高时，底物量相对就少，因此多余的酶不能与玉米浆蛋白底物结合，水解度随着酶与底物比的增大而缓慢上升直至达到平衡。从生产的经济效益方面考虑，酶与底物比3%时为最佳，水解效率高且节约用酶量。

2.2.3 时间对玉米浆蛋白水解度的影响

时间对玉米浆蛋白水解度的影响结果见图3。

图3 时间对玉米浆蛋白水解度的影响

由图3可知，玉米浆蛋白水解度在5 h前一直在增加，在5 h后水解度增幅很小，达到峰值35.5%，5 h和6 h后水解度值几乎没有变化。这是因为5 h后底物蛋白几乎被水解完全，因此水解度也就几乎不再增加，从生产成本和经济效益方面考虑，5 h为最佳水解时间。

2.2.4 温度对玉米浆蛋白水解度的影响

温度对玉米浆蛋白水解度的影响结果见图4。

图4 温度对玉米浆蛋白水解度的影响

由图4可知，在温度升高时水解度也随之增加，玉米浆蛋白水解度在55 ℃时达到最高值38.6%，然后随着温度升高而逐渐降低。这是因为中性蛋白酶在温度升高到酶活力最高的温度时水解效率最高，大于或者小于这个温度就会使酶的活性降低，从而使玉米浆蛋白水解度变低，因此最佳水解温度为55 ℃。

2.2.5 正交试验结果

根据因素水平表进行的正交试验结果见表2。

表2 中性蛋白酶水解玉米浆正交试验结果

续 表

通过极差分析，各因素影响水解度的顺序为C>B>D>A，即时间影响最明显，酶与底物比次之，然后是温度，影响最小的是pH值，由K值分析得最好的水平搭配是A2B2C3D2。通过验证试验得到水解度为44.5%，大于其他水解值结果，即采用中性蛋白酶水解玉米浆的最佳条件是温度55 ℃、pH值7.5、酶与底物比3%(W/W)、水解时间6 h。在此条件下，中性蛋白酶水解玉米蛋白粉的水解度最高可达到44.5%。

3 结论

通过对不同酶、pH值、温度、时间、酶与底物比的单因素试验和正交试验，确定酶法制备玉米浆蛋白的最佳酶解工艺，由试验得到结论：以水解度为指标，中性蛋白酶对玉米浆蛋白水解度的影响较大，当中性蛋白酶与底物玉米浆中蛋白质质量比为3%、温度为55 ℃、pH值为7.5的条件下水解6 h时，玉米浆蛋白水解度最高可达到44.5%，此时酶解效果最好。该研究为玉米浆原料的再利用提供了一定的理论基础，为玉米肽的生产提供了数据参考。