响应面法优化血管保健果醋发酵工艺参数

王锋，孙科

(1.徐州生物工程职业技术学院 生物工程系，江苏 徐州 221006；2.徐州生物职业技术学院高教研究所，江苏 徐州 221006)

山楂富含多种有机酸和黄酮类化合物，具有舒张血管、调节心机、增大冠状动脉血流量、降低胆固醇和降血压等作用[1]。木耳具有疏通血管、清除血管中胆固醇、降血糖、降血脂、防止血栓形成，预防脑血管疾病的发生等作用[2]。红枣有很好的增强肌力、消除疲劳、扩张血管、增加心肌收缩力、改善心肌营养等作用[3]。把山楂、木耳、红枣和生姜按一定比例混合，具有很好的疏通血管、降血压、降血脂的作用[4]。果醋饮品也具有调节酸碱平衡、降血压、降血脂、促进血液循环等功效[5]。在山楂果醋的酿造过程中，按比例加入木耳、红枣和生姜会提高果醋的血管保健作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂、木耳、生姜、红枣、蔗糖：市售；葡萄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌、醋酸菌XZSW001：徐州生物工程职业技术学院生物工程实训中心保藏；果胶酶：上海玉博生物科技有限公司；抗坏血酸(分析纯)：上海谱振生物科技有限公司；焦亚硫酸钠(分析纯)：上海宏顺生物科技有限公司；MRS培养基：上海创赛科技有限公司；麦芽汁培养基：上海谷研生物科技有限公司。

1.2 设备与仪器

20 L小型发酵罐 镇江东方生物工程设备技术有限责任公司；AX324ZH型奥豪斯电子天平 上海奔普仪器科技有限公司；PHS-3C型pH计 上海鼎科科学仪器有限公司；JHY-120ET型酒精计 厦门金河源科技有限公司；PAL-3型糖度仪 深圳市白鳍豚生物科技有限公司；JK-JH01型单人(单面)垂直超净工作台 安徽杰克欧德实验室设备有限公司；小型粉碎机 济南天宇专用设备有限公司；小型切片机 兴化市祥和制药机械有限公司；小型打浆机 杭州亿大科技实业有限公司。

1.3 方法

酒精发酵过程中以酒精产生量(%)和乳酸产生量(g/L)为研究对象，考察了接种量(%)、初始pH值、初始糖度(%)和发酵温度(℃)4个因素对结果的影响，通过单因素试验和正交试验得出酒精发酵的最优发酵条件组合。

醋酸发酵过程中以果醋专家感官综合评分为研究对象，考察了接种量(%)、酒精浓度(%)和发酵温度(℃)3个因素对结果的影响，通过单因素试验和响应面优化方法得出醋酸发酵的最优工艺条件。

1.3.1 工艺流程

1.3.2 酒精发酵试验

1.3.2.1 乳酸菌接种量的确定

乳酸菌和酵母菌生活条件相似，代谢产物相互影响、相互制约。乳酸菌和酵母菌混菌发酵，可以改良醋酸的口感，增加醋酸的风味。混菌发酵的关键是确定二者的比例关系，在酵母菌接种量为2.5%，初始糖度为18%，初始pH值为4.5，发酵温度为29 ℃的情况下，调整乳酸菌的接种量分别为0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，发酵结束后测定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.2 初始pH值的确定

乳酸菌和酵母菌都是酸性菌，发酵的pH值相近，混菌发酵时要综合考虑两种菌都适宜的pH值。在酵母菌接种量为2.5%，乳酸菌接种量为1.5%，发酵温度为29 ℃的情况下，设定发酵初始pH值为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，发酵结束后分别测定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.3 初始糖度的确定

在酵母菌接种量为2.5%，乳酸菌接种量为1.5%，初始pH值为4.5，发酵温度为29 ℃情况下，设定初始糖度为10%，12%，14%，16%，18%，20%，发酵结束后分别测定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.4 发酵温度的确定

在酵母菌接种量为2.5%，乳酸菌接种量为1.5%，初始糖度为18%，初始pH值为4.5情况下，设定发酵温度为21，23，25，27，29，31 ℃，发酵结束后分别测定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.5 正交试验

在单因素试验的基础上，选择乳酸菌接种量(A)、初始pH值(B)、初始糖度(C)和发酵温度(D)4个因素，以酒精度为评价指标进行L9(34)正交试验，从而确定最优的酒精发酵工艺条件。正交因素和水平见表1。

表1 酒精发酵正交因素水平表Table 1 Factors and levels of alcohol fermentation orthogonal test

1.3.3 醋酸发酵试验

1.3.3.1 接种量的确定

在初始酒精度为9.0%，发酵温度为32 ℃情况下，设定醋酸菌的接种量分别为2%，4%，6%，8%，10%，12%，发酵结束后计算果醋专家感官综合评分。

1.3.3.2 初始酒精度的确定

在醋酸菌接种量为8.0%，发酵温度为32 ℃情况下，调整初始酒精度分别为2%，4%，6%，8%，10%，12%，发酵结束后计算果醋专家感官综合评分。

1.3.3.3 发酵温度的确定

在醋酸菌接种量为8.0%，初始酒精度为9.0%情况下，设定发酵温度分别为24，26，28，30，32，34 ℃，发酵结束后计算果醋专家感官综合评分。

以醋酸菌接种量、初始酒精度和发酵温度为影响因素，专家感官综合评分为考察指标，设计响应面试验。

1.3.4 测定方法

酒精含量的测定：化学氧化法[6]；乳酸含量的测定：内标气相色谱法[7]；总糖含量的测定：斐林试剂法；总酸的测定：酸碱中和滴定法。

果醋感官评分见表2[8]。

表2 果醋感官评分表Table 2 Fruit vinegar sensory score

2 结果与分析

2.1 酒精发酵的单因素试验

2.1.1 乳酸菌接种量对酒精发酵的影响

乳酸菌的接种量对酒精发酵的影响结果见图1。

图1 乳酸菌接种量对酒精发酵和乳酸产量的影响Fig.1 Effect of lactic acid bacteria inoculum size on alcoholfermentation and lactic acid production

由图1可知，乳酸菌的接种量从0.5%逐步增加到3%时，酒精的产出量逐渐从9.6%减少到5.5%，而乳酸的产生量却逐渐从1.4 g/L增加到3.3 g/L。当乳酸菌接种量为2.0%时，乳酸菌和酵母菌协同发酵的效果最好，酒精度为7.3%，乳酸产生量为3.1 g/L。是说乳酸菌的接种量为2.0%时，对酒精发酵和乳酸发酵最适宜。

2.1.2 初始pH值对酒精发酵的影响

初始pH值对酒精发酵的影响结果见图2。

图2 初始pH值对酒精发酵和乳酸产量的影响Fig.2 Effect of initial pH values on alcohol fermentation and lactic acid production

由图2可知，初始pH值从3.0增加到5.5时，酒精的产生量和乳酸的产生量都呈现先增加再减小的趋势。当初始pH值为4.5时，酒精的产生量和乳酸的产生量同时达到最高值，分别为9.6%和3.3 g/L，即初始pH值为4.5时，对酒精发酵和乳酸发酵最适宜。

2.1.3 初始糖度对酒精发酵的影响

初始糖度对酒精发酵的影响结果见图3。

图3 初始糖度对酒精发酵和乳酸产量的影响Fig.3 Effect of initial sugar content on alcohol fermentation and lactic acid production

由图3可知，初始糖度从10%增加到20%过程中，酒精的产生量是逐渐增加的，而乳酸的产生量呈现先增加再减小的趋势。当初始糖度为16%时，酒精的产生量为9.5%，乳酸的产生量为3.3 g/L。酒精度过高或过低都会影响菌种的发酵，所以初始糖度为16%时，对酒精发酵和乳酸发酵最适宜。

2.1.4 温度对酒精发酵的影响

发酵温度对酒精发酵的影响结果见图4。

图4 发酵温度对酒精发酵和乳酸产量的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on alcohol fermentation and lactic acid production

由图4可知，发酵温度从21 ℃增加到32 ℃过程中，酒精的产生量是先逐渐增加后减小的趋势但幅度很小，乳酸的产生量也呈现先增加再减小的趋势，但比较剧烈。当发酵温度为29 ℃时，酒精的产生量为9.8%，乳酸的产生量为3.4 g/L。酒精产生量和乳酸产生量都达到最大，所以发酵温度为29 ℃时，对酒精发酵和乳酸发酵最适宜。

2.2 酒精发酵的正交试验

根据以上的单因素试验结果，设计正交试验，以确定最佳的酒精发酵工艺条件，正交试验设计表见表3。

表3 酒精发酵正交试验及结果Table 3 Results of orthogonal experiments foralcoholic fermentation

由表3可知，混菌酒精发酵最优的条件组合是：A2B2C2D2，即乳酸菌接种量为2.0%，初始pH值为4.5，初始糖度为16%，发酵温度为29 ℃。由表3还可知4个因素对酒精产量和乳酸产量影响的顺序为：D>A>B>C，即发酵温度>乳酸菌接种量>初始pH值>初始糖度。对混菌发酵的最优组合A2B2C2D2进行3组平行试验验证，发酵结果为酒精度9.6%，乳酸产量3.4 g/L。

2.3 醋酸发酵的单因素试验

2.3.1 醋酸菌接种量对总酸度的影响

醋酸菌接种量对醋酸发酵的影响结果见图5。

图5 醋酸菌接种量对醋酸发酵的影响Fig.5 Effect of acetic acid bacteria inoculation amounton acetic acid fermentation

由图5可知，发酵液的总酸度随着醋酸菌接种量的增加逐渐增大，接种量从2%增加到12%的过程中，总酸度从2.9%增大到5.9%。但总酸度的增加呈逐渐变缓趋势，综合考虑成本因素，醋酸菌接种量取10%，对醋酸发酵最适宜。

2.3.2 初始酒精度对总酸度的影响

初始酒精度对醋酸发酵的影响结果见图6。

图6 初始酒精度对醋酸发酵的影响Fig.6 Effect of initial alcohol content on acetic acid fermentation

由图6可知，发酵液的总酸度随着初始酒精度的增加呈现先增加然后减少的趋势，初始酒精度为10%时，总酸度最大，为5.9 mL/dL。因为酒精度增加会抑制菌种的活性，所以初始酒精度取10%，对醋酸发酵最适宜。

2.3.3 发酵温度对总酸度的影响

发酵温度对醋酸发酵的影响结果见图7。

图7发酵温度对醋酸发酵的影响Fig.7 Effect on fermentation temperature on acetic acid fermentation

由图7可知，发酵液的总酸度随着发酵温度的增加呈现出先增加然后迅速减少的趋势，发酵温度为30 ℃时，总酸度最大为5.8 mL/dL，因为温度增加会抑制菌种的活性，所以发酵温度取30 ℃，对醋酸发酵最适宜。

2.4 醋酸发酵的响应面试验[9,10]

2.4.1 醋酸发酵的响应面试验设计因素与水平

以单因素试验为依据，设计醋酸发酵的响应面设计因素水平，见表4。

表4 醋酸发酵响应面设计因素水平表Table 4 Factors and levels of response surface methodology on acetic acid fermentation

2.4.2 醋酸发酵的响应面试验结果与方差分析

醋酸发酵响应面试验结果见表5。

表5 醋酸发酵响应面试验设计及结果Table 5 The response surface design and experimental results on acetic acid fermentation

醋酸发酵响应面试验方差分析见表4。

表6 醋酸发酵响应面试验方差分析结果Table 6 Results of variance analysis of response surface methodology on acetic acid fermentation

注：“*”表示差异显著(P<0.05);“**”表示差异极显著(P<0.01)。

由表6可知,模型的P值<0.0001，表明回归性极显著；失拟项F值(0.79)>0.05，表明影响不显著；可行度分析R2=93.62%，表明该模式能够解释93.62%的醋酸发酵变化。所以该模型的拟合度较好，实验的误差较小，能代替真实的试验对醋酸发酵工艺条件进行分析预测。由表6可知，发酵参数A,C,A2,C2和BC对最后果醋专家的综合评分影响极显著，B和B2专家综合评分影响显著，而AB和AC对专家的综合评分影响不显著。

2.4.3 醋酸发酵的响应面试验各因素之间交互作用分析

醋酸发酵各因素之间交互作用对专家综合评分的影响见图8～图10。

图8 酒精度和接种量对专家评分的影响Fig.8 Effect of alcohol content and inoculum size on the expert evaluation

图9 温度和接种量对专家评分的影响Fig.9 Effect of temperature and inoculum size on the expert evaluation

图10 温度和酒精度对专家评分的影响Fig.10 Effect of temperature and alcohol content on the expert evaluation

2.4.4 醋酸发酵最优工艺参数确定

以软件Design-Expert 9.0 对模型进行回归分析可以发现：当回归模型值最大时，接种量(A)为9.88%，初始酒精度(B)为10.32%，发酵温度(C)为30.18 ℃，此时的专家平均评分为98.6分。结合实际情况以及为了操作方便，接种量按10%、初始酒精度按10%、发酵温度按30 ℃进行3次平行试验，专家的综合评分为98.2分，与预测值98.5分非常接近，表明该模型能非常好地预测发酵实际情况。

3 结论

通过单因素试验确定血管保健醋的酒精发酵影响参数：乳酸菌接种、初始糖度、初始pH值和发酵温度的大致范围，然后通过正交试验确定酒精发酵最优工艺参数：乳酸菌接种量为2.0%，初始pH值为4.5，初始糖度为16%，发酵温度为29 ℃。在第二阶段醋酸发酵过程，首先通过单因素试验确定醋酸发酵的影响参数：醋酸菌接种量、初始酒精度和发酵温度的大致范围，然后通过响应面方法确定醋酸发酵的最优工艺参数：醋酸菌接种量为10%，初始酒精度为10%，发酵温度为30 ℃。