辛香料植物贯叶马兜铃的根及叶挥发性成分分析及其食用风险解析

陈高，葛佳，秦燕，孙卫邦

(1.云南省极小种群野生植物综合保护重点实验室，昆明 650204；2.中国科学院东亚植物多样性与生物地理重点实验室，昆明 650204；3.中国科学院大学，北京 100049；4.云南大学 生命科学学院，昆明 650204)

辛香料植物在人民的饮食生活中扮演着重要角色，在世界范围内已经有上千年的使用历史[1]。这些香味成分被用来提升食物的颜色、芳香以及风味[2]。在东方国家，特别是中国，葱、蒜、姜、辣椒、胡椒、芫荽、五香八角、桂皮等均为传统的辛香料食用材料来源，有深厚的民间基础[3]。虽然辛香料植物能增加食物的风味，但有些成分具有潜在的风险，比如香樟中的黄樟素，鱼腥草中的、杜衡、细辛、马兜铃等已经被国际上的相关研究机构指明需谨慎使用[4,5]。考虑到中国的传统食用药材和食材通常添加辛香料增加风味，我们建议应该谨慎使用这些传统的、但没有经过详细评估的食用或药用原材料，以防止慢性中毒。

贯叶马兜铃(AristolochiadelavayiFranch.)，因其全株具有酷似姜科植物草果的浓郁辛香味，也称山草果。该植相似物主产于滇西北及川西金沙江干热和干暖河谷1580～2500 m之间(见图1)[6]。该物种是我国马兜铃科马兜铃属的特有植物[7]。当地居民使用贯叶马兜铃的干燥叶当作烹调的香料，被广泛加在食物里以增加风味，且能够有效去除牛、羊、鱼的膻味和腥味，在民间已有很长的食用历史[8]。此外，当地人们还利用其叶作健胃、增进食欲和治疗感冒、疟疾和牙痛的常备药。目前，由于分布范围有限，且被长期挖掘，该物种的野外居群受到严重的破坏，已被IUCN红色目录列为濒危物种。

最近研究发现贯叶马兜铃是一种易危麝凤蝶属昆虫幼虫的特异寄主，其取食叶片以获得防御天敌的马兜铃酸，见图 1。

图1 贯叶马兜铃及其特异寄主达摩麝凤蝶Fig.1Aristolochia delavayiand its parasitical insectByasa daemonius

注：a为贯叶马兜铃在金沙江干热河谷的植株和生境；b为叶上释放辛香味的腺毛； c为未成熟果实；d为当地销售的盒装干燥地上部分产品；e为达摩麝凤蝶的卵；f为幼虫；g为蛹；h为成虫。

目前，马兜铃科马兜铃属和细辛属植物的马兜铃酸I 和II(AAs)导致的肾衰竭、尿毒症、肝毒性的安全隐患得到了广泛的关注[9]。马兜铃属的草药也被国际癌症研究机制列为对人类有强致癌潜力的物质(Agency for Research on Cancer，2002)。在马兜铃酸的同系物中，马兜铃酸I和II成分诱导细菌、哺乳动物细胞产生突变，这些成分能直接引起肾小管细胞的破坏[10]。虽然科研人员、政府工作人员、城市居民可能知道马兜铃酸和马兜铃肾病的关系(Aristolochic Acid Nephropathy,AAN)，但生活在偏远地区的居民可能并不熟悉AAN，因此贯叶马兜铃仍在滇西北市场广泛销售。

以前的研究报道贯叶马兜铃精油中具有浓郁辛香味的成分是反式-2-十一碳烯醛，而这种成分在山草果中含量竟高达94.2%，大大超过了其在草果中的含量。但上述研究均为水蒸气蒸馏获得的精油，且研究结果和其后的结果不一致，因为葵烯醛可能才是贯叶马兜铃精油的主成分[11]。我们在调查该物种受威胁的情况时，发现当地社区居民通常将该植物的全株阴干，然后将干燥的叶搓成粉末撒在食物上。因此，我们认为直接用动态顶空吸附的方法收集的气味，才能真正代表当地居民喜欢贯叶马兜铃的挥发性气味。分析这些材料的马兜铃酸才能弄清当地居民食用该植物时的马兜铃酸摄入量。

本研究按照当地居民的食用习惯，以动态顶空吸附与GC-MS联用分析贯叶马兜铃干燥叶和根自然释放的挥发性成分，拟探讨如下问题：自然条件下贯叶马兜铃叶和根释放的挥发性辛香成分和组成比例；自然挥发物和以前水蒸气蒸馏提取的精油成分的组成和比例是否存在差异；通过对贯叶马兜铃叶和根挥发性成分的分析，结合贯叶马兜铃的马兜铃酸含量，在弄清食用贯叶马兜铃的芳香成分的同时，对马兜铃酸的摄入量进行评估，以期为当地居民的健康安全提供参考，也为保护贯叶马兜铃和达摩麝凤蝶受威胁的生态关系提供科学建议。

1 材料和方法

贯叶马兜铃的干燥叶及根材料直接采集于金沙江下虎跳三坝乡江边村哈梦龙客栈老板家的库存干物质(27°18.865′ N，100°13.679′ E, 1972 m)。模式标本保存于中国科学院昆明植物研究所的标本馆(KUN)。贯叶马兜铃的叶及根的自然挥发性成分收集装置为动态顶空吸附，具体的操作流程参见我们以前的研究方法[12]。将自然干燥的贯叶马兜铃的叶3 g放于体积为2 L的干燥器中，并用无气味的封口膜(Pechiney, Parafilm, WI 54952)包裹好，以防止外来的气味干扰叶本身的气味。环境中的空气经活性炭(天津市风船化学试剂科技有限公司)吸附净化后通过聚四氟乙烯管导入内放贯叶马兜铃干燥叶粉末材料的密封玻璃罩，并用流量计(常州市成丰流量仪表有限公司)和阀门控制进气速度。混合贯叶马兜铃辛香气味的空气通过Porapak Q吸附管(Enka Research Institute Arnhem; 60/80目)后由抽气泵(武汉市天联科教仪器发展有限公司)释放到环境中。流量计的流量设计为400 mL/min，抽气3 h。吸附结束后用500 μL重蒸正己烷反复洗脱吸附管3～4次，并加入3000 ng正壬烷作为内标，提取液直接上GC和GC-MS仪分析洗脱液成分和组成比例。为确定挥发性成分的稳定性，取不同植株的根和叶各进行4次重复实验。

气相色谱条件：仪器为美国Agilent Technologies公司的HP5890.HP-5石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱温起始为40 ℃，保持5 min，程序升温5 ℃/min，至280 ℃；柱流量为1.5 mL/min；进样温度250 ℃；氢火焰检测温度250 ℃；进样量0.3 μL；分流比50∶1；载气为高纯氮气。气相色谱-质谱条件：仪器为美国Agilent Technologies 公司的HP6890GC/5973MS气相色谱-质谱联用仪。GC条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱温起始为40 ℃，保持5 min，程序升温5 ℃/min，至280 ℃；柱流量为1.0 mL/min；进样温度250 ℃；柱前压100 kPa；进样量1.0 μL；分流比10∶1；载气为高纯氦气。MS条件：电离方式EI；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量范围35～500；采用Wiley7n.1谱库检索定性确认密蒙花挥发性化学成分，按照峰面积归一化法计算出各化学成分的峰面积相对百分含量，并用正壬烷定量植物的自然释放量，同时用标注品确认主成分反式-2-葵烯醛的真实性。

马兜铃酸的含量高低、使用频率及其摄入量和其毒性密切相关，我们最近的研究已经弄清下虎跳居民食用的贯叶马兜铃所含的马兜铃酸I和II的含量组成情况。马兜铃酸I和II在干燥叶、果和根中的含量分别为5.5，456.5，1680.4 μg/g。马兜铃酸II在干燥叶、果和根中的含量分别为55.4，192.7，980.6 μg/g。因此，本次我们仅从社区调查的角度了解当地居民对食用贯叶马兜铃的习惯是否会因为我们的科普宣传而有所改变。我们对下虎跳江边村永壳社区的56个住户的137个成年人(63女，74男)进行访谈，询问他们食用贯叶马兜铃的剂量、使用频率并告知他们食用贯叶马兜铃可能带来的健康安全隐患。对所获得数据进行分析，以期指导社区居民正确对待有争议的马兜铃科植物带来的马兜铃酸肾病或肝病问题。

2 结果与分析

本研究从贯叶马兜铃的根和叶中共检出29个化合物。从贯叶马兜铃叶中鉴定出19个挥发性成分，占挥发性成分总量的97.8%，其中反式-2-葵烯醛(79.79%)、3-十二烯醛(4.26%)、辛醛(2.49%)、反式-2-己烯醛(2.09%)和葵醛(1.80%)为主要成分。从贯叶马兜铃根中分离出16个挥发性成分，占挥发性成分总量的98.2%，其中乙酸龙脑酯(37.08%)、尼泊金丙酯(22.29%)、1,3,8-p-孟三烯(19.93%)、莰烯(6.39%)和β-蒎烯(2.21%)为主要成分，更多的细节见表1。

表1 贯叶马兜铃叶及根的挥发性化学成分组成Table 1 The volatile chemical constituents from leaves and roots ofAristolochia delavayi

续 表

我们最近的研究揭示贯叶马兜铃中的马兜铃酸Ⅰ和Ⅱ及其同系物在该物种中普遍存在，马兜铃酸Ⅰ和Ⅱ在根、叶和果实中的变化及在达摩麝凤蝶不同阶段的积累程度也各有不同。就《中国药典》2010版本规定细辛中马兜铃酸的使用标准来看，马兜铃酸I的含量不应该超过干物质的0.001%(10 μg/g)，同时药典也提醒注意马兜铃酸可能的肾毒性风险。就我们的研究来看，马兜铃酸I的含量在贯叶马兜铃干燥叶、果和根中的含量分别为5.5，456.5，1680.4 μg/g。果实和根中的马兜铃酸I都远超药典的规定标准。但叶片中的马兜铃酸I的含量低于10 μg/g的国家规定水平的最高上限。

我们对137个成年人的调查发现有11人(8.03%)认为食用贯叶马兜铃没有健康风险，他们会继续食用，有7人(5.11%)坚决表示他们以后再也不食用添加贯叶马兜铃材料的食物，其余人(86.86%)认为食用贯叶马兜铃可能有潜在风险。但鉴于周围从来没有肾病的发生，他们自己也没有不舒服感，因此认为食用贯叶马兜铃应该毒性比较小，他们会继续食用已经使用上百年的该传统香料，只是他们会考虑酌情降低使用量和食用频率。就社区的访谈来看，当地居民通常会将贯叶马兜铃的干燥叶5～10片(约0.8～1.5 g干重)揉碎后撒到已经煮熟并摆放到餐桌的食物上。或将干燥叶2～3 g放到清汤或火锅中进行煮沸后，食用去除膻味的菜肴和汤。一个家庭在贯叶马兜铃材料能保证的情况下，通常每餐都会添加一些干燥叶粉末。因此，我们按照少数民族地区每家平均5人，每天吃1次，每次1 g，贯叶马兜铃秋季成熟，食用时间为3个月，每个成人估计重约60 kg，马兜铃酸含量以5.5 μg/g叶干重来计算，每年每人每1 kg组织里面马兜铃酸I的摄入量约为1.65×10-6g/kg(不考虑代谢，假设均为积累在体内)。社区调查还发现当地居民通常不食用贯叶马兜铃的果实或根，或仅在做火锅的时候，偶尔添加根和果实增加菜肴的视觉效果和风味。

3 结论

贯叶马兜铃是滇西北和川西地区著名的辛香料传统芳香植物原料，它的干燥叶能有效去除食物中的腥味和膻味，并能增加菜肴的风味。因此，30多年前就有研究人员开展过该物种的精油组成研究。上述研究发现贯叶马兜铃的主要精油成分是反式-2-十一碳烯醛，且含量可达94.2%不等。最近其他研究者进一步的分析表明贯叶马兜铃的主要精油成分是反式-2-葵烯醛(52.0%)，而不是十一碳的烯醛。然而，和文佳等[13]最近通过研究贯叶马兜铃无菌苗和愈伤组织挥发性成分揭示其主要成分为γ-杜松烯(37.80%和35.78%)、乙酸龙脑酯(17.09%和15.54%)、8-异丙基-2,5-二甲基-5,6,7,8-四氢-1-萘酚(10.30%和19.10%)等。但上述研究均为水蒸气蒸馏获得的精油成分，且所得的结果差别较大。我们推测这种不一致性可能和不同研究者材料的来源、采集的季节和环境生长及材料存贮的条件或遗传基础有关系，也可能是挥发性成分鉴定方面不同研究者存在误判。

本研究没有采用典型的水蒸气蒸馏获得精油的研究方法，而是按照当地居民的食用习惯(直接将干燥叶片搓揉成粉末撒在食物上)，采用气相色谱-质谱联用技术对动态吸附法收集的贯叶马兜铃干燥叶的气味开展研究，我们认为这样才能代表当地居民食用贯叶马兜铃时的真正感官体验。研究表明干燥叶中主要的挥发成分是反式-2-葵烯醛(79.79%)、3-十二烯醛(4.26%)、辛醛(2.49%)等，结果和Li等的结论比较接近。此外，我们使用在Sigma购买的标准品对主要成分进行共注射比对，并比较标准品和主要成分的质谱图，结果均证明反式-2-葵烯醛应该是贯叶马兜铃挥发物中的典型主要成分。我们研究团队21人的嗅觉试闻结果也表明，标准品的气味和贯叶马兜铃干燥叶片搓揉后释放的气味难以区分。因此，虽然蒸馏处理后通常导致植物的组织细胞及代谢相关的酶产生变化，进而导致挥发物可能出现变化。但就本研究而言，蒸馏法和动态顶空吸附法的结果比较接近，仅存在主要化合物的含量变化。

虽然以前对贯叶马兜铃的叶的挥发性成分有较多研究，但对其他部分的挥发物研究却没有开展相应的工作。本研究首次报道了贯叶马兜铃干燥根的挥发性成分组成，结果发现和地上部分叶的挥发物成分差异极大。该植物根中主要成分为乙酸龙脑酯(37.08%)、尼泊金丙酯(22.29%)、1,3,8-p-孟三烯(19.93%)和莰烯(6.39%)，然而这些成分均不在我们分析的干燥叶的挥发性成分之中(见表1)。我们推测可能和贯叶马兜铃地上和地下部分的分工不同进而导致的代谢产物不同有关。值得注意的是，根中最主要成分乙酸龙脑酯却在贯叶马兜铃无菌苗和愈伤组织挥发性成分中被报道。以前的研究发现乙酸龙脑酯具有镇痛抗炎[14]的作用，而尼泊金丙酯是新颖的防腐剂[15]，这些主要成分在贯叶马兜铃中出现的原因及其日化香精方面的功能值得探索。

马兜铃酸的肾毒性早在20多年前就得到比较充分的研究，最近马兜铃酸的肝毒性再次激起公众的广泛关注。虽然科研人员、政府工作人员、城市居民可能知道马兜铃酸摄入后导致的潜在安全隐患，但偏远地区的社区居民可能并不知道使用该类植物材料存在的健康风险[16]。我们在滇西北地区做社区调查工作时，也常常遇到销售和食用贯叶马兜铃的情况。虽然2010版本的《中国药典》中规定细辛中马兜铃酸I的使用不应该超过干物质的0.001%。就本研究来看，马兜铃酸I的含量在根和果实中远超过国家规定的标准。贯叶马兜铃叶中的自然含量不高，但它里面多个马兜铃酸同系物的情况决定该类成分含量应该不会低于10 μg/g干物质(陈高等，未发表数据)。我们的社区调查发现约有86.9%的社区居民还是会选择谨慎地食用贯叶马兜铃。我们大致的评估表明一个60 kg成人每年摄入的马兜铃酸I的含量约为100 μg。最近的研究揭示马兜铃酸致癌的机制是它的代谢产物dA-AAI可以跟人体DNA形成加合物，只需要一个小碱基改变可能就会导致癌变的风险[17]。因此，对于马兜铃酸而言，可能没有安全剂量一说，摄入越多，危害越大。贯叶马兜铃根和果实中的马兜铃酸I和II的含量极高，我们建议当地居民不要在煮火锅的时候加入果实或根作为食材。虽然贯叶马兜铃叶中的马兜铃酸看起来不高，仅为干物质的0.00055%。但鉴于马兜铃酸及其衍生物的致突变性，我们建议社区居民也不要将贯叶马兜铃的叶作为食材。

以前的研究发现马兜铃科马兜铃属植物叶片通常释放多样化的气味，不同的种类之间差异极大[18]。考虑到很多凤蝶科的蝴蝶幼虫均以马兜铃科植物为特异寄主[19]，我们推测不同种类释放的独特气味可能是凤蝶类长距离定位寄主的嗅觉信号物质。此外，贯叶马兜铃的气味类似蝽类的化学防御物质，该植物在金沙江干热河谷进化出来的气味是否能驱避草食动物的过度取食，也是值得进一步研究的生态适应性问题。最后，贯叶马兜铃由于分布范围狭窄，长期受到挖掘，目前该物种的野外居群已经难觅踪迹。不知道当地居民降低食用贯叶马兜铃是否能为该物种的生存带来生机？我们希望本研究能在一定程度上为保护贯叶马兜铃及以其叶为生的达摩麝凤蝶受威胁的生态关系提供借鉴意义。