人凝血酶原复合物中凝血因子活性测定的影响因素分析

陈华英，林伟华，洪 流，许景宁，高发平

（湛江中心人民医院，广东 湛江 524045）

欧洲药典与英国药典均明确规定，对于凝血酶原复合物，需测定凝血酶活性与激活凝血因子，以上两项指标，最终目的是确保人体注射制品后降低血栓的发生率。人凝血酶原复合物（PCC），是一种具有促进血液凝固作用的静脉注射血浆蛋白制剂，涉及有凝血因子（Coagulation factor，F）Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，20 世纪60年代开始用于临床，主要治疗维生素K依赖的凝血因子缺乏症、乙型血友病等[1]。近些年，诸多专家与学者不断对其进行深入研究，且关于口服香豆素类抗凝剂过量快速逆转的研究引起了医学界的关注。自2011年以来，就国内而言，PCC短缺现象日渐严重，现如今，诸多厂家致力于研究PCC的制备工艺与临床应用[2]。本文根据实践，分析PCC中凝血因子活性测定的影响因素。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料（1）由华兰公司提供的PCC。（2）由SIEMENS公司提供的 Coagulation factorⅡ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ Deficient Plasma。（3）来自SIEMENS公司的 Thromborel S、Actin、氯化钙溶液。（4）FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活性检测试剂盒均由成都协和技术有限责任公司提供。（5）标准品1购自SIEMENS公司，标准品2购自NIBSC，标准品3购自成都协和技术有限责任公司。（6）Sigma p 4380硫酸鱼精蛋白，其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器 法国STA-R Compact血凝分析仪，金坛市医疗仪器厂生产的HH-W600恒温水浴箱，Millipore公司提供的Milli-Q Advantage纯水仪。

1.2 方法

1.2.1 空白测定 取1支塑料杯置凝血仪中，添加0.1 ml缺血小板血浆，再添加0.1 ml脑磷脂，混合均匀，保温2 min，再添加0.1 ml Tris缓冲液，添加0.1 ml 0.025 mol/L CaCl2，记录凝固时间。凝固时间≥200 s，试验成立，若＜200 s，表示试验不成立。

1.2.2 样品测定（1）硫酸鱼精蛋白。以《中国药典》（2010版）[3]为指导，使用相对应因子的乏浆（FⅨ用生理盐水稀释），对PCC制品进行稀释处理，配制成0.2 mg/ml硫酸鱼精蛋白溶液，根据欧洲药典，判定肝素钠于PCC中最大含量。用3种不同的方法处理PCC样品。样本1，添加一定浓度的硫酸鱼精蛋白溶液，混合均匀后，马上测定因子活性。样本2，不添加硫酸鱼精蛋白溶液。样品3，添加浓度相同的硫酸鱼精蛋白溶液，以37℃为准，将样本2与样本3进行15 min温浴处理。随后，应用全自动凝血仪对4种凝血因子的活性进行测定。

（2）盐离子浓度。使用相应乏浆（涉及FⅡ、FⅦ、FⅩ）与生理盐水（涉及FⅨ），稀释PCC制品于一定浓度后，添加NaCl，其中，1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L分别为制备盐离子3个梯度的浓度，在保证PCC制品中凝血因子浓度达到中国药典标准的前提下，测定凝血因子活性。

（3）标准品。采用3种不同的标准品，制作有效的标准曲线，依据中国药典处理样品，随后，基于不同标准品，测定PCC中凝血因子活性。

（4）不同厂家试剂。采用2套不同厂家的试剂，按照中国药典处理PCC制品后，测定样品中的凝血因子活性。

1.3 统计学处理

用Excel录入本次研究所涉及的所有数据，采用SPSS 20.0软件，计数资料采用百分比（%）表示，进行χ2检验，计量资料用（±s）表示，进行 t检验，P＜0.05 表示有显著性。

2 结果

通过调节脑磷脂稀释度，达到空白时间≥200 s的要求，其中，脑磷脂，按照 1∶3 000 稀释。

2.1 硫酸鱼精蛋白

PCC制品添加硫酸鱼精蛋白与不加的相比凝血因子活性偏低，但差异无显著性（P＞0.05）。添加硫酸鱼精蛋白后，有无给予37℃温浴，对凝血因子活性并无显著性影响。PCC制品添加硫酸鱼精蛋白，相比不加，FⅨ活性偏高；加硫酸鱼精蛋白后，马上进行FⅨ活性测定，相比添加硫酸鱼精蛋白且进行37℃温浴活性更高，但差异并不显著（P＞0.05），见图 1。

2.2 盐离子浓度

在3种不同盐离子浓度下，所测得的FⅦ、FⅨ活性不存在显著性差异（P＞0.05）。相比高盐离子浓度，低盐离子浓度下，所测得的FⅡ、FⅩ活性更高，差异具有显著性（P＜0.05），见图2。

图2 不同盐离子浓度对PCC中凝血因子活性的影响

2.3 标准品

对于FⅡ、FⅨ、FⅩ，不同标准品所测得的活性，标准品1＞标准品2＞标准品3；而FⅦ，则为标准品3＞标准品1＞标准品2，见图 3。

2.4 不同厂家试剂

本次研究中，主要涉及SIEMENS公司与成都协和两家的试剂，采用不同厂家试剂测定的凝血因子活性差异有显著性（P＜0.05），见表 1。

3 讨论

图3 不同标准品对PCC中凝血因子活性的影响

表1 采用不同厂家试剂测定PCC中凝血因子活性的比较[±s，IU/ml]

表1 采用不同厂家试剂测定PCC中凝血因子活性的比较[±s，IU/ml]

厂家 FⅦ1.6±0.0 2.8±1.0 FⅡSIEMENS成都协和7.3±0.8 3.5±0.3 FⅨ4.1±0.6 3.1±0.4 FⅩ4.1±0.3 5.9±1.0

硫酸鱼精蛋白是一种硫酸盐，属于碱性蛋白，于体内，中和肝素，导致肝素丧失抗凝活性[4]。从理论上讲，硫酸鱼精蛋白与肝素发生中和反应后，所测定的凝固时间呈缩减趋势，凝血因子活性升高。本研究中，凝血因子活性却下降，出现此结果，可能与过量使用硫酸鱼精蛋白有关。硫酸鱼精蛋白属于弱抗凝剂，过量使用可降低凝血因子活性。因此，临床检测时，可先对PCC中肝素含量进行测定，为准确测定凝血因子活性提供保障。

实践中，乏浆较昂贵，外源因子测定时，一般未严格遵照药典实施操作，使用配套稀释剂或纯水，进行稀释处理[5]。2005年版的《中国药典》，明确规定FⅨ予以乏浆稀释处理，而2010年版的《中国药典》，规定采用生理盐水予以稀释，关于此变化的原因还需研究。

PCC生产工艺中多选用NaCl溶液、柠檬酸钠作为洗脱剂，对于洗脱液，虽然予以了脱盐处理，但还有些许NaCl残留在PCC中，且浓度有所不同。因此，分析PCC中凝血因子活性受NaCl不同浓度的影响十分必要。就本次研究而言，在高浓度盐溶液中凝血因子活性偏低，其中，在0.25 mol/L浓度下，相比其他2种浓度，FⅨ活性较低，但无显著性差异。另外，不同标准品对PCC中凝血因子活性有一定程度的影响。本研究中，分别采用SIEMENS公司与成都协和的试剂，检测显示，PCC中凝血因子活性差异明显，可见，不同厂家的试剂对PCC中凝血因子活性亦有影响。

综上所述，在实际操作中，应综合分析影响凝血因子活性测定的因素，采取行之有效的控制措施，减少干扰因素，保证测定结果的有效性。