蛋白组学差异揭示黑曲霉（Aspergillus niger）高产柠檬酸的分子机制

谢 慧，王风清，魏东芝*

（1.华东理工大学 生物反应器国家重点实验室，上海 200237；2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002）

我国是柠檬酸生产大国，占全球市场份额的70%以上，在产量和产品质量上均具有很强的竞争力。中国柠檬酸工业的强大竞争力主要得益于生产菌种具有利用廉价淀粉类物质高产柠檬酸的强大能力[1-2]。菌株（Aspergillus niger）YX-1217是一株典型的柠檬酸高产菌株，能利用玉米粉水解液，在38～39℃发酵55h产生180.0～200.0g/L柠檬酸。然而A.nigerYX-1217在遗传上不稳定，易于自然衰退，为了保持菌株高柠檬酸产量的特性，必须定期进行菌种活化，否则会衰退为低产柠檬酸菌株（命名为A.nigerYX-1217G），产酸量只有高产菌株的70%，为企业带来巨大经济损失[3]。

常见的蛋白质组学研究方法包括二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensionalpolyacrylamide gelelectrophoresis，2-DE）、质谱技术（mass spectrometer，MS）、肽序列标签、蛋白质微阵列、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术以及其他研究蛋白质相互作用的方法如酵母双杂交系统等[4-8]。近年来，由美国应用生物系统公司（appliedbiosystems，ABI）研发的同位素标记相对和绝对定量（isobaric tagsforrelativeandabsolutequantification，iTRAQ）技术为解决低丰度蛋白质的定性及定量研究提供了有效的技术支持[9-10]。KIM Y等[11]总结了应用于曲霉蛋白质组学研究中的各种方法和技术，结果共鉴定了28个细胞表面蛋白，102个与分泌相关的蛋白以及139个胞内蛋白，同时也构建了代谢途径中关键基因的蛋白质组图谱。蛋白质组学技术不仅可以用于真菌致病机理的研究，也可用于丝状真菌的代谢网络调节研究。LU X等[12]分别以麦芽糖和木糖为碳源，对在诱导和非诱导条件下A.niger的蛋白质组进行比较，研究表明，在诱导和非诱导条件下胞浆蛋白质组并没有明显的差异，主要差异体现在胞外分泌蛋白，特别是植物细胞壁降解蛋白。蛋白质组学技术的发展，为工业菌种改造奠定基础，为改进工业发酵过程提供新的途径[13]。

本研究基于2D-PAGE和iTRAQ这两种蛋白质组学技术，将菌株A.nigerYX-1217和菌株YX-1217G的胞外分泌蛋白和胞内蛋白进行比较，重点分析和柠檬酸产生相关基因的表达差异，揭示菌株A.nigerYX-1217生产柠檬酸的高产机制，并为开发柠檬酸或其他有机酸的高产菌株提供新的思路和观点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

菌株A.nigerYX-1217和A.nigerYX-1217G：潍坊英轩实业有限公司。

1.1.2 化学试剂

尿素、硫脲、Pharmalyte 3-10、TritonX-100、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、丙磺酸、三羟甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris）、溴酚蓝：美国Sigma公司；丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺：美国伯乐公司；固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）胶条（pH 3～10，24 cm）：美国GE公司。实验所用化学试剂均为分析纯。

1.1.3 培养基[3]

玉米粉种子培养基：将250 g玉米粉加入1 L水中，搅拌均匀后不断添加耐高温α-淀粉酶（40000U/mL），在105℃条件下进行液化直到碘指示剂测试结果不显示蓝色，此时糖度大约为16～18°Bx，获得玉米粉糖化液即可用作种子培养基。

玉米粉发酵培养基：将玉米粉糖化液经两层纱布过滤，将过滤的和未过滤的玉米粉糖化液以体积比6∶1混合，混合液即为玉米淀粉发酵培养基，测定总糖质量浓度为178.1 g/L。

1.2 仪器与设备

24孔Minibeadbeater：美国Biospec公司；IP Gphor等电聚焦电泳系统、Ettan DALT Six SDS-PAGE垂直电泳系统：美国GE Healthcare公司；5415D台式高速离心机：德国Eppendorf公司；4800Plus基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflightmass spectrometry，MALDI-TOF-MS）：美国AB Sciex公司。

1.3 实验方法

1.3.1 2D-PAGE实验方案

2D-PAGE的实验方案在参考文献[6-8]的基础上做了修改，等电聚焦运行参数为水化：50 V 10 h；梯度等电聚焦：100V1h、200V1h、500V1h、1000V1h；升压程序：10000V 1 h、10 000 V 100 000 V·h、500 V 10 h。

1.3.2 iTRAQ实验方案

iTRAQ实验方案见参考文献[9-10]。

1.3.3 数据分析

本实验分析的样本为黑曲霉（A.niger），UniProt数据库中关于A.niger蛋白质的记录只有9个，而美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）匹配到的条目较多，一般来说，数据库越大，能够匹配和鉴定到的蛋白质就越多。因此，本次使用数据库为A.nigerNCBInr+Uniport合库（28 953条序列）。

2 结果与分析

2.1 菌株A.nigerYX-1217和YX-1217G生长特性与柠檬酸产量比较

菌株A.nigerYX-1217和YX-1217G在玉米粉发酵液中35℃培养60 h，发酵结果如表1所示。

表1 两株菌在35℃发酵60 h的生物量、残糖以及柠檬酸含量比较Table 1 Comparison of biomass,residual sugar,citric acid concentration of the two strains at 35℃for 60 hg/L

菌株A.nigerYX-1217是一株典型柠檬酸高产工业菌株，发酵60 h时柠檬酸产率可高达3.0 g/（L·h），此时产量为180.0 g/L，而残糖量只有3.5 g/L。与之相比，退化菌株YX-1217G在发酵60 h时柠檬酸产率只有1.1 g/（L·h），柠檬酸产量为65.0 g/L，而发酵液残糖量为43.8 g/L，其柠檬酸生产能力与菌株YX-1217相比下降了64%。总之，菌株YX-1217的柠檬酸产量比菌株YX-1217G多115 g/L，同时细胞干质量比其少15 g/L。菌株YX-1217G柠檬酸产量低的原因不仅由于发酵末期发酵液中还原糖没有被彻底消耗，且消耗的还原糖很大程度上来用于增加菌体的生物量。两株来源相同的菌，由于菌株退化而导致柠檬酸产量有较大差异，因此这两株菌是利用蛋白组学分析A.niger柠檬酸高产机制的好样本。

2.2 基于2-DE分析A.nigerYX-1217和A.nigerYX-1217G胞外分泌蛋白差异

基于二维电泳技术分析不同样本之间（菌株A.niger YX-1217和菌株A.nigerYX-1217G）胞外分泌蛋白差异，通过SWISS-PROT数据库分析，获得6个差异明显的蛋白，各点在2-DE图中的位置如图1所示。

图1 基于2-DE的菌株YX-1217和菌株YX-1217G胞外分泌蛋白比较Fig.1 Comparison of extracellular protein between strain YX-1217 and strain YX-1217G based on 2-DE

从胶上抠取差异蛋白点，用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行分析，各差异蛋白的具体信息见表2。

表2 菌株YX-1217和菌株YX-1217G样本间差异蛋白分析Table 2 Analysis of differential proteins between strain YX-1217 and strain YX-1217G

由表2可知，6个差异蛋白都为水解蛋白酶，且都具有丰度＞5-fold的明显差异（P＜0.05）。

（1）spot 1（酸性α-淀粉酶）：玉米粉液化pH为5.8～6.2，而A.niger利用淀粉液化液发酵生产柠檬酸时，其pH迅速从6.0左右降至2.5。菌株A.nigerYX-1217可分泌大量的酸性α-淀粉酶，和菌株A.nigerYX-1217G相比，其差异倍数（Fold-change）为15.6。耐酸性α-淀粉酶在低pH值的条件下，随机切断淀粉分子内的α-1,4糖苷键，生成低聚糖、麦芽糖和糊精等，使淀粉黏度下降[14]。所以菌株A.nigerYX-1217更能充分利用玉米淀粉液化液，并在培养基中生长良好。

（2）spot 2,3（葡糖糖化酶）：该酶能水解液态淀粉中的α-1,4-糖苷键和α-1,6糖苷键。水解过程中，从底物分子中的非还原端开始，逐步水解出葡萄糖。当菌株A.nigerYX-1217生产柠檬酸时，其玉米淀粉的预处理过程只需要加入α-淀粉酶进行液化，而不需要额外加入葡糖淀粉酶进行糖化，因为该菌株能分泌大量糖化酶，和菌株A.nigerYX-1217G相比，其差异倍数（Fold-change）分别为11.3和10.5。因此不仅原料利用更充分，且节约成本。

（3）spot 4（精氨酸蛋白酶）：肽链内切酶，能水解蛋白质类底物，参与机体的新陈代谢及生物调控作用。它的活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成。菌株A.niger YX-1217G可分泌大量的精氨酸蛋白酶，和菌株A.niger YX-1217相比，其差异倍数（Fold-change）为15.4。

（4）spot 5（酰胺酶）和spot 6（几丁质酶）：都为胞外水解酶类，和A.nigerYX-1217G相比，菌株A.nigerYX-1217分泌量较高，其差异倍数（fold-change）分别为7.1与5.3。能快速讲解胞外物质，使原料利用更加充分。

总之，和菌株A.nigerYX-1217G相比，菌株A.niger YX-1217具有更强大的胞外水解酶系统，能够将玉米粉水解液快速、彻底的水解成葡萄糖等糖类，为菌株提供充分碳源，这是该菌株柠檬酸高产的主要原因之一。

但是由于菌株A.nigerYX-1217产生酸性α-淀粉酶、葡糖糖化酶丰度较高，使得低丰度蛋白的获取存在一定困难，获取的蛋白点数较少，在一定程度上限制了菌株A.niger YX-1217分泌蛋白组的研究。

2.3 基于iTRAQ技术分析菌株A.nigerYX-1217和菌株A.nigerYX-1217G胞内蛋白差异

为了直接揭示这些菌株间代谢差异，每一株菌选择两个培养点（10 h和40 h）作为样品进行蛋白组学分析，共计4个样品，分别是菌株A.nigerYX-1217-10 h（S1-10），菌株A.nigerYX-1217-40 h（S1-40），菌株A.nigerYX-1217G-10 h（S3-10）菌株A.nigerYX-1217G-40 h（S3-40）。

2.3.1 蛋白质鉴定与定量

本研究使用iTRAQ技术进行蛋白质相对定量，所用的质谱仪器是Triple TOF 5600。通过Mascot软件进行分析后，匹配到的谱图数量是41330张，其中Unique谱图数量为40086张，共鉴定到3 553个蛋白。当蛋白丰度差异倍数达到1.2倍以上，且经统计检验其P值＜0.05时，视为差异蛋白。

2.3.2 差异蛋白的途径富集分析

为了探索不同样本间的代谢差异，将差异蛋白按照京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesand Genomes，KEGG）代谢数据库进行分类，尤其是与柠檬酸生物合成相关的代谢途径，如糖酵解途径（embden meyerhof pathway，EMP）、磷酸己糖途径（hexose monophosphate pathway，HMP）、三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCA）、脂肪酸代谢（fatty acid metabolism，FAM）等。菌株A.niger YX-1217与菌株A.nigerYX-1217G在碳源代谢中的差异表达分析结果见表3。

表3 涉及碳源代谢的差异蛋白分析Table 3 Analysis of differential protein involved in carbohydrate metabolism

（1）涉及糖酵解途径的差异蛋白分析

糖酵解途径在整个生长过程中实现碳源的初代谢，为菌体提供能量并为菌体生长的其他代谢和柠檬酸的合成提供必需的底物。由表3可知，糖酵解相关的一些酶在菌株YX-1217中的表达量比在菌株YX-1217中明显增加。己糖的磷酸化由己糖激酶（hexokinase，Hk）和葡萄糖激酶（glucokinase，Gk）共同作用，但是两种酶的基因彼此孤立，动力学决定性因素也不同。Hk是酵解过程EMP途径的第一个酶，是限速酶；而Gk是一个诱导酶，二者都能将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G-6-P）。在菌株YX-1217中，两个酶的表达量在10 h阶段明显增加，差异倍数分别为1.912和1.581，但是当发酵40 h时，Gk的蛋白差异不明显。6-磷酸葡萄糖异构酶（glucose-6-phosphate isomerase，Gpi）是EMP途径的第二个酶，能将G-6-P转化成F-6-P，在YX-1217菌株中，该酶的表达量在发酵10 h和发酵40 h均明显上调，差异倍数分别为1.759和1.453。磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，Pfk）在YX-1217菌株中明显下调，表达量低于菌株YX-1217G。该酶受到柠檬酸的抑制，这种抑制可以被NH4+和高浓度无机磷酸盐解除。研究表明，在菌株A.niger中柠檬酸的积累伴随胞内NH4+浓度的增加，从而解除了柠檬酸对Pfk的抑制[15-16]。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenas，Gpd）是糖酵解途径、柠檬酸循环以外的另一个葡萄糖分解途径-磷酸戊糖途径中的第一个酶，它催化6-磷酸葡萄糖脱氢形成6-磷酸葡糖酸。以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）为电子受体，整个反应的平衡是趋向于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的生成。该酶在菌株YX-1217中表达量明显上调，与菌株YX-1217G相比，差异倍数为1.647和1.445。

（2）涉及柠檬酸循环的差异蛋白分析

丙酮酸羧化酶（pyruvatecarboxylase，Pc）存在于线粒体中，是催化如下不可逆反应的关键性酶：丙酮酸+CO2+三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）+H2O→草酰乙酸+二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）+磷酸。在TCA循环中，它是供给草酰乙酸的主要补充反应，而草酰乙酸是生成柠檬酸的重要前体之一。由表3可知，在菌株YX-1217中，Pc的表达量明显增加，与菌株YX-1217G相比，差异倍数分别为2.303和2.001。柠檬酸是TCA循环中一种重要的中间体，而柠檬酸合成酶（citrate synthase，Cs），作为第一步反应的限速酶，可以催化草酰乙酸和乙酰辅酶A（coenzyme A，CoA）缩合形成柠檬酸，是柠檬酸生产中最重要的酶[17-18]。本研究鉴定出3种柠檬酸合酶Cs，这3种酶在菌株YX-1217中表达量普遍明显增加，差异倍数分别为1.617、2.013和2.532。作为柠檬酸生产过程中最关键的酶，该酶在菌株YX-1217中的高效表达可能是该菌柠檬酸高产的原因之一。然而在菌株YX-1217中，乌头酸水合酶（aconitate hydratase，Aco）和异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，Idh）表达量在种子10 h明显增加，使生成的柠檬酸继续参与代谢而被降解，从而不利于柠檬酸的积累，但同时带动TCA循环继续进行，使柠檬酸以后的步骤有被激活的迹象，产生更多的ATP来满足代谢需求。但是当发酵到40 h时，蛋白差异不明显。有报道称，在柠檬酸发酵初期，NAD-和NADP-专一性异柠檬酸脱氢酶具有很高的活性，将柠檬酸通过TCA循环转化为酮戊二酸，因此柠檬酸积累的最初阶段并没有阻断TCA循环[19]。这与得到的结果一致，高产菌株中高浓度柠檬酸刺激增加顺乌头酸酶的表达。

（3）涉及脂类代谢的差异蛋白分析

在氧气充足的条件下，脂肪酸被逐渐分解为乙酰CoA，最终彻底氧化为CO2和H2O，并释放大量的能量，这是生物体内乙酰CoA的主要来源之一。酰基CoA脱氢酶（acyl-CoA dehydrogenase，Acad）是一类用来催化细胞线粒体中脂肪酸β-氧化的第一步的重要的酶。由表3可知，其在菌株A.nigerYX-1217中的表达量比在菌株YX-1217G更高，发酵10 h差异倍数分别为1.346和2.266。甘油酯水解酶（esterase/lipase，Lps）隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。在菌株A.nigerYX-1217中，Lps表达量相比在菌株YX-1217G更高，差异倍数增大到3.373。玉米中脂肪含量3%～5%，菌株A.nigerYX-1217在甘油酯水解酶的作用下，玉米淀粉液化液中的脂肪被降解为甘油和脂肪酸，脂肪酸再进一步进行β-氧化，最终生成乙酰CoA，作为柠檬酸生产的前体物质。

（4）涉及能量代谢的差异蛋白分析

生化代谢过程，如糖酵解、三羧酸循环和β-氧化，都会产生还原型辅酶NADH。此辅酶含有高电极电势的电子，这些电子从NADH释放出来，并通过一系列的酶传递给氧气，最后以ATP的形式释放出大量能量。呼吸链相关差异蛋白结果如表4。由表4可知，许多呼吸链相关蛋白在菌株YX-1217中表达量明显增强，主要包括V型质子三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）的三个亚基A、B、E，和菌株YX-217G相比表达量增加，10 h的差异倍数分别为1.313、1.666、1.582。10 h的细胞色素b5、b-C1、C蛋白在菌株YX-1217中表达量增加，差异倍数分别为1.553、1.335、1.365。菌株YX-1217中标准呼吸链的蛋白及三磷酸腺苷酶的表达量增加，使得该菌株呼吸作用增强，在高产柠檬酸时提供维持生命的基本动力。

表4 涉及能量代谢的差异蛋白分析Table 4 Analysis of differential protein involved in energy metabolism

（5）菌株A.nigerYX-1217高产CA相关基因表达调控

为了阐明CA高产的机制，根据与CA生产的直接相关性，研究了菌株A.nigerYX-1217碳源代谢途径的表达调控，如图2所示。

图2 两株黑曲霉高产柠檬酸相关基因在10 h与40 h的表达调控Fig.2 Expression regulation of genes involving high yield citric acid in twoA.nigerstrains at 10 h and 40 h

由图2可知，菌株A.nigerYX-1217中大多数和CA产生相关关键基因的表达水平显著高于YX-1217G的表达水平。在高产菌株中，葡萄糖首先经糖酵解途径生成丙酮酸；其次丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸，为柠檬酸提供前体物质，且脂肪酸代谢为柠檬酸的产生提供另一个前体物质乙酰辅酶A，二者在柠檬酸合酶的作用下生成柠檬酸；糖酵解途径、脂肪酸代谢及三羧酸循环过程中生成的NADH和NADPH经呼吸链转化为NAD+/NADP+，确保细胞内氧化还原状态和能量代谢的平衡，否则由葡萄糖转化为CA的代谢就会停止。总之，丰富的水解酶系、不受阻碍地中心代谢流、强大的电子传递链可能是A.niger YX-1217柠檬酸高产的原因。

3 结论

基于二维聚丙烯酰胺电泳（2-DE）分析菌株A.niger YX-1217和菌株A.nigerYX-1217G胞外分泌蛋白差异。质谱分析了6个差异明显的水解蛋白，分别是酸性α-淀粉酶（An04g09890）、葡糖糖化酶（An14g02760、An04g06920）、精氨酸蛋白酶（An07g00950）、酰胺酶（An12g01020）和几丁质酶（An05g01800）。菌株A.nigerYX-1217能分泌大量的胞外水解蛋白，使其主要原料——玉米淀粉液化液被充分利用，在发酵过程中使原料从浓稠变得稀薄，菌株长势良好，产酸率提高。

将差异蛋白按照KEGG代谢数据库进行分类，结果显示与柠檬酸生物合成相关的酶在菌株A.nigerYX-1217中表达量显著增加，如丙酮酸羧化酶（An04g02090）、柠檬酸合成酶（An15g01920）、甘油酯水解酶（An09g06390）、酰基CoA脱氢酶（An17g01150）、V-型质子三磷酸腺苷酶亚基B（An02g02020）等。这些蛋白涉及糖酵解代谢、TCA循环、脂类代谢与能量代谢，这些蛋白的高效表达，是菌株A.niger YX-1217高产柠檬酸的原因之一。