内毒素休克诱导急性肾损伤家兔模型的建立

邵 俊, 方时书, 郑瑞强, 陈齐红, 林 华, 於江泉, 薛 露

(1. 江苏省苏北人民医院&扬州大学临床医学院 重症医学科, 江苏 扬州, 225001;2. 江苏省泰州市人民医院 重症医学科, 江苏 泰州, 225300)

感染性休克所致急性肾损伤(AKI)具有高发病率、高死亡率[1]。鉴于临床上很难做到对可疑或确诊AKI患者进行及时的、多次的肾脏病理学监测，因而成功建立感染性休克所致AKI动物模型就显得尤为重要[2-3]。本研究探讨内毒素诱导感染性休克家兔模型的建立以及是否存在AKI, 现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康清洁级雄性新西兰大白兔12只，购自南京安立默实验动物中心[动物合格证号SCXK(苏)2010-0002], 体质量(2.60±0.29) kg。按随机数字表法将12只新西兰大白兔分为对照组(C组)和模型组(S组)，每组6只。

1.2 主要实验试剂

大肠杆菌内毒素(LPS, E. coli血清型O55: B5)购自美国Sigma公司，兔Cr-ELISA试剂盒购自上海裕平生物有限公司。

1.3 内毒素休克家兔模型建立

S组家兔实验前禁食12 h、禁水4 h, 检测体质量后行左耳缘静脉留置穿刺，以20%乌拉坦5 mL/kg静脉注射诱导麻醉，麻醉期间予面罩吸氧(流量3 L/min), 实验过程中采用咪达唑仑0.05 mg/(kg·h)、丙泊酚0.5 mg/(kg·h)持续镇静以维持麻醉，麻醉深度以无自主运动、角膜反射消失为目标，需要时缓慢注射20%乌拉坦1 mL追加麻醉。取甲状软骨下第3、4软骨间隙先横向切开，再纵行向上切开第2、3软骨环(即倒T切开气管)，置入3.5号气管插管3～4 cm, 接呼吸机辅助通气。机械通气: 呼吸机参数设定为容量控制模式(VCV), 潮气量(VT)为10 mL/kg, 频率(f)为40次/min, 呼气末正压(PEEP)为0～2 mmHg, 吸入氧浓度(FiO2)为40%～80%, 实验过程中依据血气分析结果调整VT和FiO2使目标血气达到动脉血氧分压 [p(O2)]在80 mmHg以上，动脉血二氧化碳分压[p(CO2)]在30～50 mmHg。颈外静脉穿刺置管，置入4 F双腔中心静脉导管5～6 cm, 再经右股动脉置入3F PiCCO动脉导管，再接 PiCCO监护仪(Picco-PLUS德国PULSION公司)进行血流动力学监测。以5 F导尿管行导尿术，记录每小时尿量。经耳缘静脉持续缓慢匀速泵LPS, 总量为2 mg/kg, 为使注射液体量一致，注射液体量为2.5 mL/kg, 注射速度严格控制在约0.2 mL/min, 保证LPS输注时间为30 min左右。注射LPS后，观察平均动脉压(MAP)下降至基础的40%即认为造模成功[4]。C组家兔经耳缘静脉匀速泵入等量生理盐水。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.4 指标观测及标本留取

选择造模前基础状态(Tx)、感染性休克成模时(T0)、成模后3 h(T3)、成模后6 h(T6)为观察时间点。经中心静脉导管监测中心静脉压(CVP), 经PiCCO监护仪监测MAP、心率(HR)、心脏指数(CI)、体循环阻力指数(SVRI)、全心舒张末期容积指数(GEDVI)、心室收缩力指数(dpmax)、每搏输出量变异率(SVV)、血管外肺水指数(EVLWI)。记录各时间点的尿量、血肌酐(SCr)、动脉血乳酸(Lac)、动脉血pH值。观察6 h后处死动物，留取肾脏组织标本行HE染色和透射电镜显微镜观察肾组织结构改变。

1.5 急性肾损伤兔成模的标准

以兔感染性休克成模后6 h肾小管组织病理学病变为成模标准，成模应符合下述3项表现之一: ① 肾小管出现水肿、管腔变小; ② 上皮细胞空泡样改变，细胞界限不清; ③ 出现肾小管明显坏死。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0软件包进行分析处理。计量资料采用单因素方差分析，方差不齐时则采用非参数检验法; 二元变量的相关分析采用Pearson相关系数，若为非正态分布资料则采用Spearman相关系数。实验数据用均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血流动力学及代谢指标比较

与C组相比, S组Tx时MAP、HR、CVP、CI、SVRI、GEDVI、dpmax、SVV、EVLWI、pH、Lac无显著差异(P>0.05), T0时MAP、SVRI、GEDVI、dpmax、pH均显著下降(P<0.01), SVV、Lac显著升高(P<0.01), 而HR、CVP、CI、EVLWI均无显著变化(P>0.05); S组T3及T6时MAP、CI、SVRI、GEDVI、dpmax、pH值均较C组显著下降(P<0.01), HR、SVV、Lac显著升高(P<0.01), CVP、EVLWI均无显著变化(P>0.05)。S组组内与Tχ比较, T0、T3、T6时MAP、CI、SVRI、GEDVI、dpmax、pH较Tχ显著下降(P<0.05), HR、Lac显著升高(P<0.01), 而CVP、EVLWI均无显著差异(P>0.05), SVV在T0时较Tx时升高，但差异无统计学意义(P>0.05), T3、T6时显著升高(P<0.01)。C组上述指标在组内各时间点比较均无显著变化(P>0.05)。见表1-3。

2.2 肾功能指标

S组6 h总尿量为(27.00±7.62) mL, 显著少于C组的(81.33±6.74) mL (P<0.01)。S组SCr在注射内毒素后呈现上升趋势，从Tx时的(16.10±0.76) μmol/L升至T6时的(31.56±1.53) μmol/L, 组内各时间点差异均有统计学意义(P<0.05), 且T0后各时间点与C组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 C组和S组不同时间点血流动力学指标比较

与C组比较, *P<0.05, **P<0.01。

表2 C组和S组不同时间点血流动力学指标比较

与C组比较, **P<0.01。

2.3 肾组织HE染色和透射电镜下结构改变

HE染色镜下见C组肾小球、肾小管结构完整，染色均匀，细胞形态完整清晰; S组6只家兔肾小球结构完整，肾间质有炎细胞浸润，肾小管出现水肿、管腔变小，上皮细胞空泡样改变，细胞界限不清，但未见有明显坏死表现。

表3 C组和S组不同时间点血流动力学指标比较

与C组比较, **P<0.01。

C组肾脏超微组织病理学改变: 肾组织超微结构正常，内皮窗孔清晰，内皮与基底膜连接紧密，基底膜无增厚、无肿胀，厚薄均匀，足突清晰、排列整齐、均匀，呈栅栏状; 近曲小管上皮细胞核仁明显，线粒体丰富少量溶酶体颗粒沉积，微绒毛丰富，排列致密有序，细胞基底部与基底膜连接紧密。

S组肾脏超微组织病理学改变: 肾小球细血管结构完整，毛细血管内皮细胞肿胀，部分线粒体水肿、胞质空泡化，内皮细胞间隙缩小，基底膜完整连续，足突细胞肿胀，系膜间质可见炎性细胞浸润; 肾小管上皮细胞腔面微绒毛部分缺失、脱落、紊乱，细胞内溶酶体及吞噬细胞泡增多，胞质部分空泡变性。肾小管上皮细胞可见皱缩、染色质浓缩、核裂解，可见部分凋亡小体。按组织病理学成模标准，实验组6只家兔均造模成功。

3 讨 论

Langenberg C等[5]系统回顾近40年来有关感染性休克所致AKI的组织病理学研究，其中仅有20篇可以用作统计分析，其中14篇是来自于动物模型，且一半以上是用LPS诱导的AKI模型，成模标准并非一致，选择的动物亦不相同。本研究采用LPS诱导造模，并以肾小管组织病理学变化来确认内毒素休克所致AKI的家兔模型的建立。

本研究中模型组动物在接受内毒素后均出现了MAP的下降，下降幅度均较基础值超过40%, 且同时表现出CI下降、SVRI下降、HR增快、GEDVI的下降，是明显的低排低阻的血流动力学状态。内毒素性休克的主要病理生理改变包括有效循环血容量的不足、组织灌注不足、细胞核组织器官功能的损害，其血流动力学状态为“高排低阻”[6-8]。杨毅等[9]研究提示如未进行有效液体复苏，感染性休克的血流动力学特点为“低排高阻”状态。本研究结果提示，在T0时表现为心输出量和外周阻力均下降状态，但在Tx至T0造模的时间段内观察到PiCCO提示外周阻力是有上升的，但此段时间为观察造模阶段, MAP并未达到预设目标, SVRI维持上升一段时间后出现持续下降。陈秀凯[10]研究提示，在2 min内给予新西兰大白兔匀速缓慢注射2 mg/kg的LPS可以诱导内毒素休克模型，其模型成功时间在60 min内。本研究为更好地模拟内毒素的持续释放入血效应，给予30 min的注射时间，观察结果提示成模时间在60～90 min, 这也许正是本研究的实验结果出现成模时间晚，但心肌抑制和外周血管舒张更严重的原因，即在T0时表现出“低排低阻”现象。

2012年最新的改善全球肾脏病预后组织(KDIGO)指南推荐仍采用SCr作为诊断AKI的重要指标[11-14]。本研究中SCr在LPS致内毒素休克后持续升高，模型组Tx时SCr为(16.09±0.76) μmol/L, T6时为(31.56±1.53) μmol/L, T6时SCr为Tx时的1.96倍; 且模型组观察时间窗内总尿量仅为对照组的1/3左右，尿量明显减少。按照KDIGO指南标准，家兔在LPS诱导后至观察时间终点T6时已出现内毒素休克所致AKI。

虽然目前对感染性休克所致AKI的组织病理学研究较少，且存在争议，但是多数学者[15-18]赞同肾小管细胞受损是其病理组织学基本特征的观点。Langenberg C等[5]研究提示在已有的感染性休克所致AKI的患者组织病理学资料中，急性肾小管坏死(ATN)的出现率不足25%, 而在灵长类动物感染性休克所致AKI的模型中ATN的出现率也仅为37%左右，在大鼠感染性休克所致AKI的模型中ATN只在23%的样本中可观察到。可见只有少数的组织病理发现有典型的ATN的表现，大多数形态正常或仅出现轻微非特异性的改变[19]。本研究中，兔肾脏组织在光学显微镜下可观察到肾小球结构完整，肾间质炎性细胞浸润，肾小管出现水肿、管腔变小，部分刷状缘消失、上皮细胞空泡样改变，细胞界限不清，但未见有明显ATN表现，这一观察结果与CaiTaway等[20]在脓毒症狒狒的肾脏病理切片中观察到的特点相似，与李锦艳等[21]研究LPS致大鼠AKI后观察到的肾脏病理学结果一致。此外，经透射电镜观察到的肾脏近端小管上皮细胞的损伤性变化，进一步证实了LPS可诱导出内毒素休克性AKI。

感染休克所致AKI的组织病理学特点除了肾小管上皮细胞损伤外，细胞凋亡也是其主要表现形式[22-23]。张彧等[24]研究提示，脓毒症早期肾组织细胞凋亡数量增加，与细胞因子等大量释放有关。Jo SK等[25]研究提示，肾小管上皮细胞凋亡可能是内毒素血症时肾损伤的潜在机制。Li Wan等[19]在绵羊脓毒症休克模型制作中进一步证实了这一机制的可能: 肾小管上皮细胞中的致凋亡蛋白BAX升高，而抑制凋亡的蛋白Bcl-xL下降，提示在脓毒症早期的肾脏中细胞凋亡机制即可被激活。本研究中透射电镜观察肾脏组织时发现肾小管上皮细胞有皱缩、染色质浓缩、核裂解现象，甚至可见凋亡小体。这一结果进一步证实了本研究成功复制出内毒素休克性AKI的家兔模型。