钙掺杂调节四氧化三铁纳米酶活性及其抗病毒作用

唐 燕, 杨雪琴, 高利增, 3

(扬州大学, 1. 医学院; 2. 转化医学研究院;3. 江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室, 江苏扬州, 225001)

纳米酶是具有类酶催化活性的纳米材料，能够在近生理条件下催化生物酶的底物，其催化行为、反应动力学和催化机制均与天然酶相同，因此属于新一代人工模拟酶[1-4]。与天然酶和传统的模拟酶相比，纳米酶具有催化效率高、功能多、稳定性好、成本低、易于大规模制备等优点，尤其是在生物医学领域，纳米酶不仅可以用于快速检测多种细菌、病毒、肿瘤标志物和血糖[5], 还可以应用于肿瘤诊断和治疗[6]、抗耐药菌和生物膜[7]、保护细胞以及抗衰老[8]等与人类健康相关的重要领域。

目前围绕纳米酶的研究主要包括开发和设计新型纳米酶、催化机制和应用3个方面。目前约有50多种不同种类和结构的纳米酶被开发，主要包括金属氧化物纳米酶、贵金属纳米酶和碳类纳米酶。四氧化三铁(Fe3O4)纳米酶属于较早发现的典型的金属氧化物纳米酶。作者在2007年首次报道了Fe3O4纳米颗粒具有类过氧化物酶催化活性[9], 能够催化辣根过氧化物酶(HRP)的底物，即过氧化氢(H2O2)和颜色底物，在酸性条件下产生与酶催化一致的颜色反应。2012年顾宁课题组[10]又发现Fe3O4纳米酶具有过氧化氢酶(CAT)催化活性，可以在中性条件下将双氧水分解为氧气和水。因此Fe3O4纳米酶具有过氧化物酶和过氧化氢酶活性，两种活性的发挥依赖于环境pH值。由于Fe3O4纳米材料还具有优良的磁学性能，将催化与磁性相结合将进一步拓展这一材料在生物医学领域的应用[11]。

Fe3O4纳米酶为什么能够模拟HRP和CAT的活性呢？通过分析天然HRP和CAT蛋白结构特点发现，这两种天然酶催化活性中心均为铁卟啉(porphyrin)，而且正是卟啉环中心的铁原子通过变价效应对催化起到了至关重要的作用(图1A)。相应的，在Fe3O4纳米酶表面存在大量的二价铁(Fe2+)和三价铁(Fe3+), 这些铁与氧形成特定的纳米晶体结构[12](图1B)。与天然酶中的铁相似, Fe3O4纳米酶表面的铁原子也具有变价能力，因此能够模拟天然酶催化活性。众所周知，天然酶作为一种蛋白质其催化过程除了活性中心外，周边的原子或氨基酸残基也参与催化过程，并对活性具有调节作用。比如HRP酶的铁卟啉活性中心的周边有组氨酸的咪唑环参与催化过程。受此启发，作者在2017年发现将组氨酸修饰到Fe3O4纳米酶表面可以提高其过氧化物酶和过氧化氢酶活性。进一步分析HRP酶的结构特点，有报道[13]发现该蛋白在催化活性中心的远端还具有2个钙(Ca)原子(图1A), 有可能对催化活性也具有调节作用。作者据此推测钙有可能影响Fe3O4纳米酶的催化活性。

根据上述科学假设，作者研究了钙掺杂到Fe3O4纳米酶的条件和方法，验证和分析了钙掺杂到纳米结构的效率，对比了掺杂后对两种酶催化活性的影响，并检验了钙掺杂Fe3O4(Ca-Fe3O4)纳米酶的抗病毒效果，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB)、无水氯化铁和乙二醇均从Sigma公司订购，室温避光储存备用。30% H2O2、三水醋酸钠和氯化钙均从生工公司订购，室温储存备用。犬肾细胞(MDCK)用于分离和培养流感病毒，由扬州大学兽医学院重点实验室惠赠，流感病毒(A/Chicken/jiangsu/1/2013, H3N2-IFV), 分离于活禽市场，由本实验室鉴定扩增保存。

1.2 实验方法

1.2.1 钙掺杂Fe3O4纳米酶的制备: 通过水热合成法制备Ca元素掺杂的Fe3O4纳米酶。首先, 0.82 g的无水氯化铁通过磁力搅拌完全溶于40 mL的乙二醇中，形成澄清的溶液。接着，缓慢加入3.6 g的三水醋酸钠，快速搅拌，形成均匀混悬液。再加入适量的氯化钙，充分搅拌，再超声10 min, 使上述溶液充分的混合均匀。然后，将溶液转移至50 mL聚四氟乙烯反应釜中。最后，将反应釜置于200 ℃下加热12 h。待反应釜自然冷却到室温后，得到黑色沉淀物，即Ca元素掺杂的Fe3O4纳米酶。然后，用乙醇和水洗涤产物各3次。最终，将得到的黑色沉淀物分散在乙醇中，放置4 ℃冰箱待用。利用场发射扫描电子显微镜(SEM)(型号S-4800, 日本日立公司)、透射电子显微镜(TEM)(型号Tecnai 12, 荷兰Philips公司)、X射线光电子能谱仪(XPS)(型号ESCALAB250Xi, 美国ThermoFisher Scientific)、马尔文激光粒度仪(型号Zetasizer Nano, 英国Malvern公司)分别进行了尺寸和形貌、元素扫描和定量分析、表面电势进行了物理化学表征。

1.2.2 钙掺杂对Fe3O4纳米酶过氧化物酶活性的影响: 催化底物 H2O2的酶促动力学参数测定，检测方法是在200 μL的体系中，将10 μg的Ca-Fe3O4纳米酶加入到0.1 mol/L、pH值4.5的醋酸钠溶液中，加入40 μg的TMB, 加入不同量的H2O2,通过酶标仪检测652 nm下的光吸收值，并在 37 ℃下测量反应速率5 min。对于纳米酶，加入H2O2的浓度梯是0、18.63、37.13、74.25、148.50、297.59、594.00、1 188.00 mmol/L。相应的米氏方程(Michaelis-Menten kinetics)曲线和反应速率通过使用GraphPad Prism7软件获得。

1.2.3 钙掺杂对Fe3O4纳米酶的过氧化氢酶活性的影响: 校正溶解氧电极，检查校正参数，用5%新鲜配制的亚硫酸钠开始校正“零氧”，随后在空气中校正“满度”，保存校正结果报告。检测方法是在3 mL的体系中，将150 μg的Ca-Fe3O4纳米酶加入到0.1 mol/L、pH值4.5的醋酸钠溶液中，加入不同量的H2O2, 静置10 min后，利用溶氧仪检测氧气产生的速度。应用GraphPad Prism7软件对实验数据进行统计分析，采用米氏方程分析催化参数并比较催化效率。

1.2.4 钙掺杂Fe3O4纳米酶的抗病毒测试: 检测其对胞内抗H3N2-IFV病毒增殖的作用，将活病毒液感染MDCK细胞，充分吸附1 h后弃病毒液，加入含不同浓度Fe3O4纳米酶的培养基, 5 d后取上清液，测血凝(HA)效价。其对H3N2-IFV的直接灭活的效应，先将不同浓度的纳米酶分别与等量H3N2-IFV液充分混合作用1 h和24 h后，直接测其HA效价。

2 结 果

2.1 钙掺杂Fe3O4纳米酶的制备与表征

作者采用了常规的水热合成法(又称溶剂热法)合成了Fe3O4纳米酶，这是合成制备该类纳米酶最常用的的实验方法。整个反应体系在密闭的反应釜内进行，加热到200 ℃会产生高压环境，引发纳米颗粒成核聚集。这一合成方法不仅简便快速易于规模化生产，而且可以在反应液中加入化学分子或高聚物，合成好的纳米颗粒表面就会修饰上相应的化学物质。基于这一反应特色，作者在纳米酶合成反应的前体液中加入适量的氯化钙，待Fe3O4纳米酶合成好后即可实现钙的掺杂。实验中作者发现在容积为50 mL的反应釜中经过1个制备过程可以得到约300 mg Fe3O4纳米酶。运用扫描电子显微镜和透射电子显微镜来观察Ca元素掺杂后Fe3O4纳米酶的形态及粒径，通过Ca元素掺杂前后的SEM和TEM图片，可以看出纳米酶大致呈球形，粒径均在200 nm左右，没有明显的差别(见图1C、1D)。掺杂了Ca之后，纳米酶表面发生了褶皱，这种形貌将会增大纳米颗粒的比表面积。

元素扫描分析显示，掺杂后的纳米颗粒表面含有钙元素(图2A、B)运用能量色散谱仪(EDS)来检测Fe3O4纳米酶掺杂的Ca元素含量。通过钙元素掺杂前后的EDS图片可以看出，能谱数据显示出了Ca元素的特征峰，这表明Ca元素掺杂到Fe3O4纳米酶。运用X射线光电子能谱对Ca元素掺杂的Fe3O4纳米酶掺杂中的Ca元素进行定性分析。如图3A所示，作者发现Ca-Fe3O4拥有Fe3O4的特征谱，但是由于Ca元素的含量很少，没有显示出其特征峰。元素定量分析显示Ca元素掺杂的量为0.057%(原子比)，而在Ca-Fe3O4纳米酶和Fe3O4纳米酶中铁的含量基本一致(图3B、C)。运用动态光散射技术检测了Ca-Fe3O4纳米酶表面所携带的电荷特征。如图3D所示, Ca元素掺杂后可以显著提高Fe3O4纳米酶表面的正电荷。表面电荷的多少将会影响纳米酶的催化效率，掺杂后改变表面电荷的Ca元素有可能改善纳米酶的催化活性。

A. 天然酶HRP中钙原子;B. 钙掺杂到Fe3O4纳米结构的示意图;C. SEM分析Fe3O4纳米酶掺杂钙前后的变化;D. TEM分析Fe3O4纳米酶掺杂钙前后的变化

图1酶催化中的钙及Fe3O4纳米酶钙掺杂的表征

2.2 钙掺杂调节Fe3O4纳米酶催化活性

钙掺杂降低了Fe3O4纳米酶的过氧化物酶活性。作者主要运用酶动力学反应参数来确定Ca掺杂的Fe3O4纳米酶的过氧化物酶活性。Fe3O4纳米酶同样具有与辣根过氧化物酶相似的活性，酸性条件下能催化(TMB)与H2O2发生颜色反应。因为这一反应存在2个底物，作者首先分析了针对H2O2为变量的反应动力学过程，即固定纳米酶和TMB的浓度，调整双氧水的浓度。米氏方程模型数据拟合得到的参数，钙掺杂前后Fe3O4纳米酶的动力学曲线基本一致(图4A)。最大反应速率Vmax相差不大(图4B), 亲和常数Km显著增高, Fe3O4纳米酶为(252.70±49.29) mmol/L, 而Ca-Fe3O4纳米酶为(316.90±49.79) mmol/L(图4C)。 以Vmax/Km代表反应催化效率，与Fe3O4纳米酶相比, Ca-Fe3O4纳米酶的过氧化物酶活性降低(图4D)。

A. 钙掺杂到Fe3O4纳米酶的元素扫描图像; B. Fe3O4纳米酶掺杂钙前后的元素谱图2 钙掺杂的元素扫描分析

其次，作者分析了针对TMB的反应动力学过程，即固定纳米酶和双氧水的浓度，调整TMB的浓度。钙掺杂前后Fe3O4纳米酶催化动力学曲线均符合米氏方程(图5A), 钙掺杂前后Fe3O4纳米酶的最大反应速度相差不大, Ca-Fe3O4纳米酶略高(图5B)。但是对TMB的亲和力钙掺杂后降低，反映到亲和常数Km, Ca-Fe3O4纳米酶为(0.58±0.07) mmol/L，而Fe3O4纳米酶为(0.31±0.05) mmol/L。因此同样的计以Vmax/Km计算催化效率，钙掺杂后降低了Fe3O4纳米酶过氧化物酶催化活性(图5D)。Fe3O4纳米酶对底物TMB的米氏常数Km值小，可能与纳米颗粒表面的物理和化学性质有关，比表面积大，表面电荷丰富，形貌复杂，容易吸附带正电的TMB, 造成较高的亲和力。而Ca-Fe3O4纳米酶表面带有正电荷，不利于TMB的结合，因此表观的催化活性较低。

A. Ca-Fe3O4纳米酶和Fe3O4纳米酶的XPS对比图; B. Fe3O4纳米酶掺杂钙前后的铁原子比例;C. Ca-Fe3O4纳米酶中的钙原子比例; D. Fe3O4纳米酶掺杂钙前后的表面电势变化

A. Michaelis-Menten反应动力学拟合; B. 最大反应速度Vmax比较; C. 亲和常数Km比较; D. 催化效率比较

图4过氧化物酶活性分析(过氧化氢变量)

钙掺杂增强Fe3O4纳米酶的过氧化氢酶活性。在中性条件下这一催化活性将双氧水分解为氧气和水，因此检测这一反应过程主要是根据溶液中氏方程(图6A)。但与Fe3O4纳米酶相比,Ca-Fe3O4纳米酶的最大反应速度变大，达到(13.04±0.77) mg/(L·s), 而Fe3O4纳米酶为(11.90±0.81) mg/(L·s)溶解氧的含量来进行的。运用溶氧仪来检测Ca元素对Fe3O4纳米酶的过氧化氢酶活性的影响。如图6所示，整个催化动力学曲线也符合米氏方程(图6B)。Km变化更为显著, Ca-Fe3O4纳米酶为(328.80±48.65) mmol/L, 而Fe3O4纳米酶为(724.20±95.96) mmol/L。以Vmax/Km计算催化效率则Ca-Fe3O4纳米酶增强2倍左右。这些结果表明掺杂了Ca元素后，纳米酶的过氧化氢酶活性得到了改善。

A. Michaelis-Menten反应动力学拟合; B. 最大反应速度Vmax比较; C. 亲和常数Km比较; D. 催化效率比较

图5过氧化物酶活性分析(TMB变量)

A. Michaelis-Menten反应动力学拟合; B. 最大反应速度Vmax比较; C. 亲和常数Km比较; D. 催化效率比较

图6过氧化物氢酶活性分析(双氧水变量)

2.3 Ca-Fe3O4纳米酶的抗病毒效应

流感病毒的增殖与细胞水平的氧化应激(活性氧, ROS)相关，而上述Ca-Fe3O4纳米酶具有过氧化物酶和过氧化氢酶活性，可以调节ROS水平，因此作者推测Fe3O4纳米酶可能影响病毒在宿主细胞内的生长和繁殖。作者选用了禽流感病毒H3N2-IFV侵染MDCK细胞的实验模型(图7A), 结果显示Ca-Fe3O4纳米酶能够显著抑制H3N2-IFV在细胞内的增殖，血凝测试表明200 μg/mL的Ca-Fe3O4纳米酶抑制病毒滴度降低8倍(图7B)。此外，作者还发现将Ca-Fe3O4纳米酶与H3N2-IFV病毒直接混合作用1 h, 随后检测病毒HA效价发现，经Ca-Fe3O4纳米酶处理后病毒效价也可以降低8倍，而Fe3O4纳米酶虽然也能降低病毒效价，但效果没有前者好(图7C)。这些实验结果表明Ca-Fe3O4纳米酶不仅具有抑制禽流感病毒胞内增殖的作用，还可以直接破坏病毒表明的血凝素，降低病毒的毒力。

A. 纳米酶细胞内抗病毒示意图; B. Ca-Fe3O4纳米酶抑制细胞内流感病毒增殖滴度变化;C. Ca-Fe3O4纳米酶直接降低病毒HA效价

图7钙掺杂Fe3O4纳米酶的抗病毒效应

3 讨 论

通过参考天然酶中钙原子的存在形式，作者提出了将钙掺杂到Fe3O4纳米酶中进而调节纳米酶的催化活性。作者利用水热法成功将钙掺杂到Fe3O4纳米酶纳米结构中，物理化学表征表明钙掺杂后没有显著改变纳米颗粒的尺寸，但使纳米颗粒表面形貌粗糙度增加，表面电势增强。酶反应动力分析表明钙掺杂降低了Fe3O4纳米酶的过氧化物酶催化活性，但是增强了过氧化氢酶催化活性。此外，作者发现钙掺杂显著提高了Fe3O4纳米酶抗病毒效应，不仅可以抑制流感病毒在细胞内的增殖，还能直接破坏病毒的效价。这些研究初步表明，钙掺杂可以调节Fe3O4纳米酶的催化活性，并且增强其抗病毒作用。