钙敏感受体在大鼠肾草酸钙结石形成中的作用

李 朋，王勤章，钱 成，徐 浩，申茂磊，郝志强，钱 彪

石河子大学医学院第一附属医院 泌尿外科，新疆石河子 832000

泌尿系结石是泌尿外科最常见的疾病之一，其中肾结石比较多见，但肾结石的形成机制和发病原因目前仍未完全明确。肾部位的结石主要为草酸钙等含钙结石[1-2]，有研究表明钙的代谢异常是导致含钙尿路结石形成的重要因素之一，高钙尿引起尿液相对过饱和诱发了含钙结石的形成[3]。钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)会使肾小管髓袢升支粗段钙的重吸收受到抑制，尿钙排泄率增加，进而形成高钙尿诱发了含钙结石的形成[4-6]。我们推测CaSR在大鼠肾草酸钙结石的形成过程中起着非常重要的作用。本研究对CaSR在草酸钙结石形成过程中表达水平进行动态观察，对其在结石形成中的作用机制进行初步探讨。

材料和方法

1材料 SPF级雄性Wistar大鼠60只，6周龄左右，体质量(210±15) g，购自新疆医科大学实验动物中心[合格证号SCXK(新)2013-0001]。多功能光学显微镜及图像采集系统(BX40，日本Olympus公司)，CaSR抗体(英国Abcam公司)。

2大鼠肾结石模型的建立及实验分组 参照孙稳[7]的方法制作大鼠肾结石模型。适应性喂养1周后按照随机数字表法将60只SPF级雄性Wistar大鼠分为空白对照组与结石组，每组各30只。空白对照组给予正常饮水每日每只2 ml灌胃2周；结石组给予1%乙二醇饮水和2%氯化铵每日每只2 ml灌胃2周。1 ～ 10周每组每周处死3只大鼠并取其双侧肾标本。

3肾组织形态学检测 连续10周肉眼观察大鼠肾形状、体积大小以及颜色变化；两侧肾各取一部分组织用甲醛液固定，石蜡包埋后使用解剖显微镜进行大体形态及结石晶体形成观察。

4肾组织HE染色 将一部分石蜡包埋后的肾组织标本制成切片，将切片固定于载玻片上，常规HE染色切片，光学显微镜下观察结晶的形成情况及肾病理改变，并按照文献[8]提供的肾结晶分级判定标准进行统计，0级判定为阴性结果，表示肾组织内未发现有结晶形成；Ⅰ～Ⅳ级判定为阳性结果，分别表示肾组织内结晶形成的程度。

5免疫组织化学检测CaSR的表达 选取成功建立模型的另一部分肾组织做免疫组织化学染色。免疫组化采用SP法，石蜡包埋后切片4μm，常规脱蜡，H2O2处理清除内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液抗原修复，血清封闭。滴加CaSR抗体(1∶150)，4℃孵育过夜，滴加二抗，DAB显微镜下控制显色，苏木素复染，不同浓度乙醇和二甲苯脱水，树胶封片，显微镜下观察1 ～ 10周两组Wistar雄性大鼠肾CaSR免疫组织化学染色情况。

结 果

1肾组织HE染色病理改变 光学显微镜下观察，造模期间正常对照组大鼠肾组织冷冻切片内未见结晶沉积，无病理学改变(图1A)。第2周起结石组部分大鼠肾可见肾小管上皮细胞脱落或肾间质淋巴细胞浸润及数量不等透明晶体，多数晶体以不规则碎片出现于肾小管中，部分见于集合管、间质及被膜下，并伴有部分肾小管扩张、上皮细胞空泡样变性及小管上皮肿胀；第5 ～ 10周肾组织结晶量多，细胞排列紊乱，肾小管多畸形，肾小管管腔扩大或因上皮细胞肿胀而变窄，扩大腔内多有坏死脱落样物，肾小球多形状不规则甚至坏死，以肾小管内为著(图1B)。

2肾结晶形成情况及分级 正常对照组大鼠肾组织未见结晶。第3周起结石组大鼠肾切片可见明亮晶体，主要分布于远曲小管，近曲小管及部分肾小球周围，形态不规则，晶体多呈零星散在分布，少量晶体呈互相连接成片或成堆，结石组与正常对照组之间成石率(因结石组大鼠在第3周开始成石，而前两周已处死的大鼠也存在成石的可能，所以在计算成石率时将两组内前两周已处死的大鼠排除在大鼠总计数之外)见表1。

图 1 第9周两组大鼠肾组织HE染色对比(HE×200) A：对照组；B： 结石组Fig. 1 Comparison of HE staining in renal tissue at the 9th week in both groups (HE×200) A: control group; B: calculi group

3肾组织CaSR免疫组织化学检查结果 光学显微镜下观察到第1 ～ 2周结石组与对照组大鼠肾组织均有CaSR的表达但没有明显差异，主要定位于肾小管上皮细胞的细胞膜上，呈棕褐色。第3 ～ 10周对照组大鼠肾组织CaSR的表达较第1 ～ 2周无明显变化，结石组大鼠肾组织CaSR的表达强度则逐渐增强且明显高于对照组，镜下可见结石组肾组织CaSR呈高度表达且弥漫分布。见图2。

表1 两组大鼠肾组织结晶分级Tab. 1 Grading of crystallization in two groups

讨 论

泌尿系结石以草酸钙等含钙结石最为多见[9-11]。尿液中游离钙增高是泌尿系结石形成的主要危险因素[12-14]。钙敏感受体是G蛋白偶联受体家族的一员，在调节全身Ca2+动态平衡中起主要作用[15-16]。有研究表明，CaSR在肾表达于肾小管髓袢升支粗段[17]，激活后通过改变细胞旁途径的渗透性来降低肾小管髓袢升支粗段对钙的重吸收。据此我们推测，CaSR在肾草酸钙结石的形成过程中起着重要的作用。

本研究结果发现第1 ～ 2周结石组与对照组大鼠肾组织病理改变无差异，免疫组化显示两组大鼠肾组织CaSR表达水平无明显差异。第3周开始，结石组大鼠肾体积逐渐增大，颜色渐渐变浅和发白，皮髓结构不清晰，且在皮髓交界处可见淡黄色颗粒沉积，触之有沙粒样感觉；HE染色可见结石组大鼠肾切片有明亮晶体；免疫组化观察到第3 ～ 10周结石组CaSR的表达程度逐渐增强且明显高于对照组。而第3 ～ 10周对照组大鼠肾组织的HE染色结果以及肾组织中CaSR的表达水平与第1 ～ 2周相比并未发生明显改变。因此笔者认为CaSR表达水平在大鼠肾组织含钙结石的形成过程中起着至关重要的作用，可能是通过肾组织CaSR激活CaSR-紧密连接蛋白-14(Claudin-14)通路，Claudin-14高度表达能够阻断由Claudin-16和Claudin-19构成的细胞外阳离子通道，使细胞旁途径的渗透性发生改变，从而降低了肾小管髓袢升支粗段对钙的重吸收，Ca2+排泄增加，尿路中游离钙增多，促进了含钙结石的形成[18-19]。

综上所述，本研究发现CaSR的表达强度在大鼠草酸钙结石形成过程中存在动态改变，在结石形成过程中起着非常重要的作用，之后将进一步探讨泌尿系含钙结石的形成机制，为临床治疗提供有力依据。