负压创面疗法对铜绿假单胞菌感染创面炎性因子表达的影响

王国旗，唐佩福

解放军总医院 骨科，北京 100853

流行病学数据显示铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是皮肤软组织感染的常见致病菌之一，皮肤软组织感染患者中有8.3% ～ 11.1%为铜绿假单胞菌感染[1-2]。最新研究发现铜绿假单胞菌感染在院内感染患者中占据相当比例，并且有上升趋势，尤其是在骨科严重创伤及截肢患者中[3-5]。铜绿假单胞菌在创面8 h即可形成生物膜并且其引起的创面炎症反应明显强于较为常见的金黄色葡萄球菌[6-7]。我们早前研究发现，与常压环境相比，体外负压环境下铜绿假单胞菌毒素产量减少、运动能力受到限制，体内负压创面疗法可以减少创面细菌数量[8-9]。然而，创面的愈合不仅受到外界细菌数量和毒素的影响，创面愈合过程中自身局部炎性因子表达变化也是影响创面愈合的关键因素。因此，炎性因子表达变化的探索也可能会揭示创面愈合的相关机制。IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α是感染过程中重要的炎性因子，能够反映感染程度并调控激活重要免疫细胞，其中IL-8和TNF-α具有促进炎症反应的作用[10-13]。本研究对负压创面疗法与常规无菌纱布治疗铜绿假单胞菌感染创面的局部炎症反应及炎性因子表达进行比较，并对铜绿假单胞菌感染创面中性粒细胞进行分层计数，以深入探索负压创面疗法对感染创面局部免疫表达及炎症反应强度的影响。

材料和方法

1实验动物 选取巴马香猪18只，购自解放军医学院医学动物中心，体质量15 kg左右，雌性，术前适应性饲养1周。本研究经解放军总医院动物伦理委员会审批。

2铜绿假单胞菌感染创面的模型建立 常规麻醉、玛贝拉脱毛膏脱毛、消毒，然后在巴马香猪背部建立一个直径50 mm深达肌肉层的软组织创面，去除肌肉腱膜，充分止血后接种0.5 ml(总菌量约为5×107CFU)铜绿假单胞菌菌液，涂抹均匀，半透明膜敷料覆盖24 h，以确保细菌的稳定黏附和定植。

3分组及处理 半透明膜敷料覆盖24 h后(建模成功，0 d)将巴马香猪随机分为实验组(负压创面疗法)和对照组(无菌纱布)并分别进行治疗。每天密切观察敷料变化情况，每2 d更换敷料1次。负压创面疗法组敷料购自武汉维斯第公司，对照组纱布为临床常用无菌纱布。整个治疗过程中两组未采用抗生素等其他治疗措施。分别于0 d、4 d、8 d、12 d、16 d定量检测创面大小，充分麻醉后切取创面肌肉组织2块(每4 d取材1次)，大小约为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，重量不低于200 mg，取材时注意标记创面侧。用于炎性因子表达水平检测的标本保存于-80℃冰箱中，用于组织病理学检测的标本保存于10%中性甲醛溶液中。

4荧光定量PCR检测创面炎性因子表达 IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达变化采用荧光定量PCR方法进行检测。首先提取总RNA，然后将其反转录为cDNA，最后按照荧光定量PCR说明书分别加入反应试剂、引物、提取的总RNA样品等进行PCR反应。荧光定量PCR数据处理方法：变化的倍数(fold change)＝2-ΔΔCT；ΔΔCT=(CT靶基因-CT内参)实验组-(CT靶基因-CT内参)对照组。

5HE染色和中性粒细胞计数 将在10%中性甲醛溶液中固定好的标本逐级脱水，然后经二甲苯等处理，石蜡包埋。切片时按照从创面表面侧到深部的方向切。切片经烘烤、脱蜡、二甲苯、乙醇水化、苏木精染色、伊红乙醇染料染色、脱水、封片等步骤完成HE染色。中性粒细胞计数按照早前Bassetto等[14]的研究方法将HE切片从创面表面至深部分为三层，按照表面到深部的顺序依次定义为浅层 (0 ～ 1.5 mm)、中层 (2.0 ～ 3.5 mm)、深层(4.0 ～ 6.0 mm)。在每一个层次中随机选取5个高倍视野，对视野范围内的所有中性粒细胞进行计数，取平均值。

6统计学方法 采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量数据以±s表示。采用两因素重复测量资料的方法分析方法对上述指标进行比较，事后检验采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1创面IL-1β的表达 治疗前4 d负压创面疗法组和对照组IL-1β表达水平均呈上升趋势，但第4天时两组差异无统计学意义。在第8天后负压创面疗法组IL-1β表达水平明显低于对照组(P＜0.01)。到治疗的第16天两组IL-1β表达水平已降落至造模初期。见图1。

2创面IL-6的表达 治疗第4天对照组IL-6表达水平高于负压创面疗法组(P＜0.01)。治疗第8天两组IL-6表达水平达最高峰，此后开始下降。治疗第12天和第16天负压创面疗法组表达水平依然低于对照组(P＜0.05，P＜0.01)。见图2。

3创面IL-8的表达 与IL-6类似，在治疗第4天两组IL-8表达水平差异无统计学意义。而与IL-6不同的是IL-8在整个治疗期间均呈现上升趋势，而且在治疗第8、12、16天负压创面疗法组表达水平明显高于对照组(P均＜0.01)。见图3。

4创面TNF-α的表达 与建模初期相比负压创面疗法组TNF-α表达水平逐渐下降；而对照组在治疗第8天呈现上升趋势，第8天达到顶峰，之后开始下降。治疗第8天及以后负压创面疗法组TNF-α表达水平均低于对照组。见图4。

图 1 两组创面IL-1β表达水平比较(aP＜0.01， vs 对照组)Fig. 1 Comparison of relative expression of IL-1β between two groups (aP＜0.01, vs control group)

图 2 两组IL-6表达水平对比(aP＜0.05， bP＜0.01， vs 对照组)Fig. 2 Comparison of relative expression of IL-6 between two groups (aP＜0.05, bP＜0.01, vs control group)

图 3 两组IL-8表达水平对比(aP＜0.01， vs 对照组)Fig. 3 Comparison of relative expression of IL-8 between two groups (aP＜0.01, vs control group)

图 4 两组TNF-α表达水平对比(aP＜0.01， vs 对照组)Fig. 4 Comparison of relative expression of TNF-α between two groups (aP＜0.01, vs control group)

5创面中性粒细胞计数 在中层和深层两种治疗方法中性粒细胞计数差异无统计学意义，而且随着治疗时间的延长变化不大。而在浅层，建模成功(0 d)至治疗第4天两组中性粒细胞计数呈现明显上升趋势，但负压创面疗法组中性粒细胞计数明显少于对照组(P＜0.01)。而治疗第4天之后两组计数均开始下降，实验组治疗的第8、12、16天时中性粒细胞计数明显低于对照组(P均＜0.01)。分层示意图及中性粒细胞计数统计分析结果见图5。

图 5 两组不同层次组织内中性粒细胞的定量分析，其中NPWT-1，-2及-3分别代表浅层、中层、深层(aP＜0.01，NPWT-1 vs control-1)Fig. 5 Comparison of neutrophil count in different layers between two groups, NPWT-1,-2 and -3 represent the superf i cial layer,intermediate layer and deep layer, respectively (aP＜0.01,NPWT-1 vs control-1)

讨 论

软组织感染后创面要经历复杂细胞因子分泌过程以调动机体免疫，感染过程中的免疫应答需要细胞间、细胞和细胞因子间的相互作用和调控。在感染早期多以固有免疫为主，而中性粒细胞是固有免疫的重要细胞，它会从血管内向损伤处聚集，这个过程中需要借助多种细胞因子的调控。

IL-1β是一种趋化因子，会导致炎症细胞募集和促炎因子扩增，从而清除铜绿假单胞菌。因此，在铜绿假单胞菌被清除后创面IL-1β表达水平下降[15]。IL1-β由活化的单核巨噬细胞分泌并通过激活IL-1受体促进中性粒细胞的募集，以此加强感染部位的免疫对抗[16]。本研究中治疗的第4天两组IL-1β表达水平明显高于建模初期，这明显有助于中性粒细胞的募集，进而加强对铜绿假单胞菌清除。两组治疗第4天以后IL-1β表达水平开始下降。实验组中性粒细胞计数少于对照组，说明此时实验组炎症反应相对较轻。中层和深层中性粒细胞计数显示细菌感染创面后炎症反应未波及到中层和深层组织，在治疗过程中中性粒细胞的变化主要集中在创面的浅层。

IL-6是感染早期监测的重要指标之一，常用于新生儿感染以及脓毒症的监测，其表达水平反映了炎症反应强度[17-18]。本研究发现在治疗的前8 d两组IL-6表达均呈现上升趋势，之后开始下降，而整个过程中负压创面疗法组表达水平相对较低，提示负压创面疗法组炎症反应相对较轻，这与创面中性粒细胞计数一致。IL-8是由单核巨噬细胞以及上皮细胞分泌的小分子蛋白，也具有一定的趋化和激活中性粒细胞的作用[19-20]，有研究报道IL-8对表皮细胞的角化具有一定作用[21-22]。两种治疗方法下IL-8均呈现上升趋势，而且负压创面疗法组表达水平相对更高。可能原因：1)尽管IL-8表达水平与两组创面炎症反应程度相反，但现有研究并不清楚其在趋化中性粒细胞的因子中发挥作用的比例，其表达水平可能解释不了创面的炎症反应强度变化；2)IL-8也可能在创面愈合中发挥了作用。TNF-α作为一种促进炎症反应的细胞因子广泛参与到感染过程中炎症反应的各个阶段，也可以起到连接固有免疫和获得性免疫的作用[23]。然而不同浓度的TNF-α发挥不同的作用，当其浓度过高时可以刺激NF-κB(核转录因子)，影响中性粒细胞的正常凋亡，还可导致血管内皮细胞的损伤，最终导致局部中性粒细胞聚集损伤正常组织[24]。本研究中早期对照组TNF-α表达升高，这一现象与创面明显出现坏死组织相符，而负压创面疗法组则保持模型建立初的水平，在治疗第8天后开始下降。在整个治疗过程中实验组表达水平明显低于对照组。其可能原因：1)模型建立成功时是感染明确形成的标志，此时创明炎症反应相对强烈，在随后的治疗中负压组创面细菌、生物膜成分快速被清除，可能避免了炎症反应的进一步加强，也不需要更多的促炎因子释放和参与；2)负压创面疗法可能抑制了促炎因子的表达与释放，进而表现为创面炎性因子表达水平相对较低。

中性粒细胞计数显示早期两组计数均高于建模初期，且对照组更高。此时正是中性粒细胞发挥作用的时期，创面会出现局部软组织坏死，对照组更为明显。然而负压创面疗法可以通过引流作用将分泌物及坏死物质及时引流走，最大程度保持创面的清洁，而对照组只能在每次更换敷料时获得一次清洁。之后两组中性粒细胞计数均下降，而且实验组下降更快，说明实验组创面炎症反应相对较弱，间接反映了创面的清洁程度，这也与细菌计数一致。而另一个原因可能是负压创面疗法对创面新生肉芽组织的刺激作用，这个加强了创面的再生，避免了炎症的持续。

早前研究表明，NPWT产生的负压作用可以影响宿主细胞的生理变化，如改变骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的基因调控和表达水平、抑制BMSCs增殖活动[25]。本研究发现，相对于对照组，NPWT的负压作用可以抑制IL-1β和TNF-α的表达，促进IL-6和IL-8的表达。可能原因：1)负压的物理刺激作用改变了创面细胞的生理活动，从而出现炎性因子的表达变化；2)负压创面疗法治疗时的引流作用可以将创面过多的分泌物和非定植的细菌及时引流至体外，减少了引起炎症反应的刺激物。上述因子表达变化的结果导致了实验组浅层创面中性粒细胞计数相对较少，减轻了感染状态下的过度炎症反应。

本研究也存在不足之处，首先，未对负压环境下不同细胞因子之间的相互调节和作用进行深入探讨。其次，仅检测部分炎性因子的表达水平。

综上，与传统无菌纱布治疗相比，负压创面疗法促进部分炎性因子的表达，利于创面早期调动免疫反应，同时抑制促炎因子的过度表达，改善创面的过度炎症反应。