果蝇Hey蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

刘松年，荆凌华，伍 星，王俊红

(河南科技大学临床医学院 河南科技大学第一附属医院 急诊科，河南 洛阳 471003)

Hey基因属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子超家族，具有bHLH结构域、Orange结构域和C末端的YRPW保守四肽。哺乳动物的Hey基因通常作为Notch信号通路的靶基因，参与心血管系统形成、神经发生、骨骼和骨骼肌发育等[1]。Hey2基因敲除小鼠出现明显的心血管缺损畸形[1]；Hey1基因高表达与胶质瘤的发生和侵袭相关[2]。作为哺乳动物Hey基因相对应的同源基因，果蝇Hey基因的功能尚未系统研究[3]。序列比对分析表明，果蝇Hey与哺乳动物Hey的bHLH结构域具有97%的序列相似性；因此，研究果蝇Hey基因的功能和调控将为哺乳动物Hey基因的相关研究提供重要参考。本研究表达并纯化Hey-His融合蛋白，进而免疫新西兰大白兔制备抗Hey抗体，为进一步研究Hey基因在发育中的功能和调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料:W1118果蝇和pET28a载体(本实验室保存)。Trizol试剂(Invitrogen公司)；cDNA合成试剂盒、高保真PCR扩增试剂盒、限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4连接酶、质粒提取试剂盒和DH5α感受态细胞(TaKaRa公司)；BL21(DE3)感受态细胞(CWBIO公司)；Ni-IDA亲和纯化试剂盒、Protein A亲和纯化试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒和HRP标记的羊抗兔IgG(Sangon公司)；弗氏免疫佐剂(Sigma公司)。SPF级雌性2.3 kg新西兰大白兔(河南科技大学实验动物中心，批号160603)。

1.2 方法

1.2.1 pET28a-Hey重组质粒的构建:按照Trizol试剂的说明书提取W1118果蝇胚胎的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性，Nanodrop检测其浓度和纯度。以质检合格的RNA作为模板反转录合成第一链cDNA；然后以cDNA合成反应液作为模板，PCR扩增Hey基因的编码序列；两端分别添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。正向引物为：5′-GCCG AATTCATGGATCACAACATG-3′；反向引物为： 5′-TAACTC GAGTCAATAGGCCATCTC-3′(GENEWIZ公司)。PCR反应条件为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35个循环；72 ℃ 8 min。

pET28a载体和PCR产物分别用EcoRⅠ和XhoⅠ于37 ℃酶切2 h，凝胶回收试剂盒纯化酶切产物。纯化产物在T4连接酶作用下20 ℃连接4 h，转化DH5α感受态细胞，然后涂板培养。提取阳性菌落的质粒进行酶切分析，经过酶切验证后送至TaKaRa公司进行测序。

1.2.2 Hey-His融合蛋白的表达与纯化:将pET28a-Hey重组质粒转化BL21(DE3)细胞，涂板培养，挑取单菌落接种于LB培养液中，37 ℃过夜培养。然后将菌液以1∶100转种至1 L培养液中，37 ℃振荡培养。当A值达到0.6左右时，添加IPTG至终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导表达4 h。离心收集菌体并用PBS悬浮，超声裂解后离心收集上清和沉淀，SDS-PAGE鉴定，并按照Ni-IDA亲和纯化试剂盒的说明变性条件下纯化融合蛋白。

1.2.3 抗体制备与特性检测：将纯化的融合蛋白常规免疫1只新西兰大白兔。初次免疫于背部皮下多点注射；第21、35和49天分别加强免疫。第59天颈动脉取血，离心分离血清。按照Protein A亲和纯化试剂盒的说明纯化抗血清。将融合蛋白包被微孔板后，采用间接ELISA检测抗体效价。提取W1118果蝇胚胎的蛋白样品进行SDS-PAGE，转膜封闭后，依次加入抗Hey多抗(1∶1 000)，HRP标记羊抗兔IgG(1∶2 000)，DAB显色，以检测抗体特异性。

2 结果

2.1 pET28a-Hey重组质粒构建:本次实验所提取的总RNA浓度为258 ng/μL，A260/A280为2.03；琼脂糖电泳结果显示，18 S条带宽而亮，无拖尾和弥散等，表明RNA是完整的，纯度符合标准。PCR产物经电泳后显示，在约1 300 bp位置出现

特异性条带。重组质粒酶切分析结果(图1)显示，EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后得到1 296 bp的目的片段，对阳性质粒进一步测序未发现点突变和移码突变。

M.DNA marker; 1.EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ digestion; 2.Xho Ⅰ digestion图1 pET28a-Hey重组质粒的酶切分析Fig 1 Enzyme digestion analysis of pET28a-Hey recombinant plasmid

2.2 Hey-His融合蛋白的表达与纯化:IPTG诱导表达产物的SDS-PAGE结果显示，在约49 ku位置出现特异的目的条带，未加IPTG的菌液没有发现该条带，表明Hey-His融合蛋白在诱导后有表达，且主要以包涵体形式存在。纯化融合蛋白的SDS-PAGE显示，在约49 ku位置有明显条带(图2A)，灰度分析表明其纯度为89.1%，测量浓度为1.3 mg/mL。

2.3 抗体制备与特性检测结果:间接ELISA检测抗体的效价为1∶256 000。利用该抗体对果蝇胚胎的总蛋白进行Western blot分析，结果发现在约47 ku位置出现特异性条带，用免疫前血清检测时没有观察到该条带(图2B)。

3 讨论

果蝇Hey基因是根据小鼠Hey1基因的序列，通过检索表达序列标签数据库而鉴定出来。原位杂交实验发现果蝇Hey基因的mRNA从胚胎期Stage 10开始出现，主要定位于中枢神经系统的脑和腹部神经索；免疫染色表明Hey蛋白主要表达于有丝分裂后的新生神经元和胶质细胞。初步的功能分析发现，果蝇Hey作为Notch信号的靶基因参与神经节母细胞的不对称分裂，但具体分子机制有待进一步阐明[3]。前期本实验室成功构建了UAS-Hey转基因果蝇品系，与GAL4品系杂交引起Hey基因过量表达，并出现异位刚毛等异常表型，表明Hey基因可能在神经系统发育过程中发挥重要作用。

本实验结果表明，本实验室成功构建了pET28a-Hey重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)后，添加IPTG诱导表达，对不同实验条件下的表达产物进行SDS-PAGE分析，以选择最佳的蛋白表达诱导条件，最后确定IPTG终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导4 h。表达的Hey-His融合蛋白主要存在于包涵体中，在变性条件下(6 mol/L盐酸胍和8 mol/L尿素)，经Ni-IDA琼脂糖层析柱纯化。纯化后Hey-His融合蛋白的纯度为89.1%，满足后续免疫对抗原的要求。另外His标签非常小，免疫原性也相对较低，对目的蛋白自身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白的可溶性、结构和生物学功能。间接ELISA和Western blot检测发现制备的抗体具有很高的效价和良好的特异性。采用制备的抗体进行Western blot发现果蝇胚胎组织中Hey蛋白高表达，提示Hey蛋白在果蝇胚胎发育过程行使关键功能。

A.the expression and purification of Hey-His fusion protein; M.protein marker; 1.total protein of BL21(DE3) without induction; 2.total protein of BL21(DE3) with IPTG induction; 3.the purified fusion protein; B:specificity analysis of anti-Hey antibody by Western blot, M.protein marker, 1.anti-Hey antibody, 2.preimmune serum图2 Hey-His融合蛋白的诱导表达和抗Hey抗体的特异性分析Fig 2 The expressed Hey-His fusion protein with induction and specificity analysis of anti- Hey antibody

总之，抗Hey蛋白抗体的成功制备为应用免疫染色、免疫共沉淀等方法进一步研究Hey基因在发育过程中的功能及调控奠定了基础，也对哺乳动物Hey基因的相关研究提供参考和借鉴。