miR-145对胰腺癌细胞系PANC-1上皮间质转化及肿瘤干细胞增殖的影响

邓大炜，吴 斌，严 舒，兰 川，张光年，曾丽娟，李建水*

(川北医学院 1.肝胆胰肠疾病研究所； 2.附属医院 肝胆外科； 3.附属医院 信息科，四川 南充 637000)

肿瘤干细胞(tumor stem cells, TSCs)是肿瘤复发、转移和耐药的根源，其比例与肿瘤的恶性程度成正相关[1-3]。近年来发现，发生了上皮间质转化(EMT)的肿瘤细胞可产生部分干细胞特性，同时肿瘤干细胞又具有EMT的特征，EMT在肿瘤干细胞的发展中扮演重要角色。miRNAs的异常表达可介导肿瘤干细胞的致瘤性、耐药性与EMT调控肿瘤的侵袭转移[4-6]。研究证实，miR-145在组织中广泛存在，在膀胱癌、乳腺癌、肾癌和非小细胞肺癌中异常低表达，参与了肿瘤的发生、发展[7-11]。目前，国内外对miR-145在胰腺癌EMT与肿瘤干细胞中的研究较少。本研究通过转染miR-145过表达慢病毒进入胰腺癌细胞系PANC-1，观察过表达miR-145后对PANC-1发生EMT及肿瘤干细胞增殖的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

人胰腺癌细胞系PANC-1(中国科学院上海细胞库);人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(川北医学院肝胆胰肠研究所);RPMI 1640、DMEM培养基和10%胎牛血清(Hyclone公司);miR-145过表达慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司);细胞总RNA提取试剂盒、PCR反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒、SYBY Green染料、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物(TaKaRa公司)；Western blot试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、OCT4多克隆一抗、兔抗人GAPDH多克隆抗体一抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(生工生物工程公司)。

1.2 材料与方法

1.2.1 实验分组:将PANC-1细胞分为：miR-145组(感染miR-145过表达慢病毒)、对照组(感染阴性对照慢病毒)和空白组(未经处理的细胞)。

1.2.2 慢病毒感染:取对数期PANC-1细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，以感染复数(multiplicity of infection，MOI)40，每孔加入5 μg/mL聚凝胺(polybrene)，24 h后更换完全培养基，扩大培养，72 h后在倒置荧光显微镜下观察荧光强度及进行下一步检测。

1.2.3 细胞黏附实验:检测miR-145组和对照组细胞黏附能力：取PANC-1和HUVEC 926细胞悬液各100 μL接种于96孔板内除第1、7、12列的A-D、E-H排孔内，过夜培养。次日取miR-145组细胞悬液100 μL/孔加至96孔板第3至7列A-H孔内，对照组细胞悬液100 μL/孔加入第8至12列A-H孔内，第1列所有孔内均加入100 μL无血清培养基。每隔30 min分别依次轻轻吸出3、8列，4、9列，5、10列，6、11列所有小孔的培养液。以上所有孔均用PBS液洗后加入100 μL无血清的培养基。1 200 r/min离心10 min,离心后 2、7、12列所有小孔处理同前。除D、E排外的所有孔内加20 μL MTT，4 h后去上清液,每孔加150 μL二甲亚砜(DMSO)，震荡均匀后在波长为570 nm下测量A值。计算干miR-145组同(异)种黏附率=[A同(异)种各时间点-A2ABC(FGH)]/A7ABC(FGH);对照组同(异)种黏附率=[A同(异)种各时间点-A2ABC(FGH)]/A12ABC(FGH)，并用荧光显微镜观测D和E排各孔荧光，摄像。

检测空白组细胞黏附能力的变化：方法同miR-145组或对照组，只需将次日铺板的细胞换成空白组PANC-1细胞。

1.2.4 瘤球形成实验检测肿瘤干细胞特性:取对数期PANC-1细胞，制成单细胞悬液，PBS缓冲液洗涤后无血清培养基重悬，调整为1×104个/mL,在低吸附6孔培养板中每孔加入2 mL细胞悬液，常规培养。隔天观察并拍照留存，每隔3～4 d换液，约10～12 d后培养板中出现悬浮、透亮、折光性强的细胞球时拍照、收集肿瘤细胞备用。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测mRNA的表达:用Trizol法提取细胞总RNA，测得RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，用CFX96热循环扩增仪扩增各目的基因，以GAPDH为内参(miR-145以U6为内参)。miR-145反转录引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACAGGGAT-3′。根据各目的基因2-△△Ct表示miR-145、E-cadherin、N-cadherin和OCT4 mRNA的相对表达水平。每个样本设3个复孔，实验重复3次。定量引物序列见表1。

1.2.6 蛋白质印迹(Western blot)检测蛋白质的表达：提取总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取蛋白浓度。行SDS-PAGE凝胶电泳，每孔道蛋白上样量50 μg，恒流电泳2 h。参照Maker切胶，湿法转膜至PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵育一抗E-cadherin、N-cadherin、OCT4过夜，次晨复温，TBST漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(稀释比例1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，ECL显影、保存图像，用Fusion FX7灰度分析软件测吸光度值分析吸光度值，结果以目的蛋白吸光度值与内参吸光度值的比值表示。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 慢病毒转染率达90%

感染72 h后，对照组与miR-145组PANC-1细胞内可见绿色荧光的表达。对照组与miR-145组PANC-1细胞中慢病毒转染效率均达90%左右(图1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

图1 转染72 h后PANC-1细胞内见绿色荧光蛋白表达Fig 1 Green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope 72 hours after transfection(×200)

2.2 miR-145过表达慢病毒显著上调PANC-1细胞miR-145 mRNA表达

miR-145在PANC-1细胞系中低表达，转染miR-145过表达慢病毒后miR-145 mRNA表达水平较对照组上升(67.22±2.66)倍(P<0.05)(图2)。

2.3 上调miR-145改变PANC-1黏附能力

同种黏附实验中(图3A、3B)，miR-145组细胞黏附率高于对照组(P<0.05)(表2)。异种黏附实验中(图3C、3D)，miR-145组细胞黏附率低于对照组(P<0.05)(表3)。

2.4 上调miR-145降低PANC-1单克隆瘤球形成能力

相对于对照组与空白组，miR-145组PANC-1形成的瘤球更少(P<0.05)，瘤球直径也更小(P<0.05)，提示上调miR-145后抑制PANC-1细胞成瘤能力(图4)。

2.5 miR-145能调控E-cadherin、N-cadherin与OCT4 mRNA和蛋白质的表达

miR-145组的PANC-1 细胞中E-cadherin mRNA和蛋白质表达显著高于对照组与空白组(P< 0.05)。miR-145组的PANC-1 细胞中N-cadherin与OCT4 mRNA和蛋白质的表达明显低于对照组与空白组(P<0.05)(图5)。

*P<0.05 compared with control group and blank group图2 miR-145过表达慢病毒上调miR-145的表达Fig 2 Expression of miR-145 mRNA was increased after transfecting over-expressed lentiviral

A.adhered cells of control group in homogeneous cells intercellular adhesion experiment; B.adhered cells of miR-145 group in homogeneous cells intercellular adhesion experiment; C.adhered cells of miR-145 group in heterologous cells intercellular adhesion experiment; D.adhered cells of control group in heterologous cells intercellular adhesion experiment

图3 不同处理组PANC-1细胞同种及异种黏附力

*P<0.05 compared with control group and blank group.

表3 不同处理组PANC-1细胞异种黏附率Table 3 Heterogeneous cells intercellular rates in PANC-1 cells in various

*P<0.05 compared with control group and blank group.

3 讨论

人类大约有30%的蛋白质受microRNAs的调控，其功能参与生长发育、新陈代谢、肿瘤的发生发展等。miRNAs作为重要的基因调控因子参与肿瘤干细胞的自我更新、分化、增殖和EMT等过程[4]。miR-145作为抑癌基因在组织中广泛存在。miR-145可通过调控肿瘤干细胞参与肿瘤的增殖、侵袭、转移、EMT及耐药。例如miR-145增加结肠癌干细胞对5-氟尿嘧啶与奥沙利铂的敏感性，减小药物的不良反应，有效的治疗结肠癌复发[12]。但miR-145能否调控胰腺癌发生EMT及对胰腺癌干细胞特性的影响尚未有相关报道。

本研究发现过表达miR-145后明显增加胰腺癌细胞同种黏附能力，显著降低了胰腺癌细胞异种黏附能力及体外成球能力，减弱了肿瘤细胞干性获得能力。EMT是细胞形态从上皮表型转化为间质表型的过程，伴有细胞极性消失、运动能力增强、黏附能力减弱等现象。其主要分子机制为“钙黏蛋白转换”即上皮细胞分子标志物E-cadherin等表达下调，而间质表型标志物N-cadherin等表达上调[13]。肿瘤干细胞主要受干性相关基因的调控，其中干性基因OCT4是维持胚胎干细胞与多功能干细胞特性的关键转录因子，同时OCT4也是目前已知最重要的肿瘤干细胞调控因子之一[14]。为了探讨上调miR-145后发生黏附能力改变与肿瘤细胞干性获得能力减弱的分子机制，本研究检测了细胞内E-cadherin、N-cadherin与OCT4 的表达水平， 结果显示细胞内E-cadherin表达上调，N-cadherin与OCT4表达下调，提示过表达miR-145后在转录水平抑制PANC-1细胞中E-cadherin、N-cadherin与OCT4的表达。这可能导致肿瘤细胞间黏附能力增加，不易从母体脱落，而且脱落的细胞发生“阿米巴运动”能力减弱，使EMT发生逆转。同时，肿瘤的干性调控基因表达下调，导致肿瘤细胞的干性获得能力减弱。

A.blank group; B.control group; C.miR-145 group图4 不同处理组细胞单克隆瘤球形成能力Fig 4 Spheroid formation capacity in various groups(×40)

*P<0.05 compared with control group and blank group图5 不同处理组E-cadherin、N-cadherin与OCT4 mRNA和蛋白质的表达Fig 5 Expressions of E-cadherin,N-cadherin and OCT4 mRNA and proteins in various

综上所述，上调miR-145的表达可以促进胰腺癌EMT的逆转，降低胰腺癌肿瘤干细胞特性获得，研究结果为临床胰腺癌的基因靶向治疗提供实验与理论依据。