Annexin 1抑制BCG诱导的巨噬细胞RAW246.7细胞炎性应答及凋亡

姬文兰，王启源

(陕西省结核病防治院 内科， 陕西 西安 710100)

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)是典型的胞内致病菌，存在于宿主的巨噬细胞内[1]。巨噬细胞凋亡对于寄生于其中的M.tb至关重要[2]。M.tb可通过多种机制对巨噬细胞的凋亡进行调控，而这种调控与其在宿主细胞内的命运密切相关，对结核病的发生、发展及预后具有重要影响[3]。因此，巨噬细胞凋亡的研究可以进一步明确M.tb的致病机制，近年来己成为国内外研究分枝杆菌的热点。

膜联蛋白A1(annexin 1，ANXA1)是结构相关钙依赖的磷脂结合蛋白超家族成员之一，参与调控炎性反应、细胞凋亡、细胞分泌和信号传导等进程[4]。ANXA1作为一个重要的炎性调控蛋白，主要参与调节宿主免疫系统中炎性反应，在炎性代谢产物产生、中性粒细胞/单核细胞与内皮细胞黏附的过程中起重要作用，可作为诱导免疫炎性紊乱治疗的新靶点。ANXA1能够抑制巨噬细胞中炎性因子IL-6和TNF的表达水平[5]。ANXA1缺失小鼠对M.tb感染高度敏感；而且ANXA1在M.tb感染的人外周血单核细胞中低表达，表明低表达的ANXA1在M.tb的免疫逃逸机制中具有重要作用[6]。此外，ANXA1缺失有损于宿主抵抗M.tb的适应性免疫应答[7]。

本研究拟通过探讨ANXA1对BCG感染后的RAW246.7促炎细胞因子及细胞凋亡率的影响，揭示其对BCG诱导的巨噬细胞炎性应答及凋亡的调控作用。研究结果有助于进一步揭示M.tb与巨噬细胞之间相互作用的分子机制，为新型结核疫苗的研发及抗结核药物靶点的筛选提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

卡介苗菌株(Bacillus Calmette-Guerin vaccine，BCG；上海生物制品研究所有限公司)；RAW264.7巨噬细胞(中科院上海细胞研究所)；ANXA1过表达质粒(pCMV-ANXA1；Ori-Gene公司)，Rrizol试剂盒(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Promega公司)；SYBR Premix Ex TaqⅡ(Qiagen公司)；BCA蛋白检测试剂盒(Pierce公司)；PVDF膜(Millipore公司)；ANXA1、Bax、Bcl-2、caspase- 3和GAPDH抗体(Abcam公司)；ECL化学发光试剂盒(Thermo Fisher公司)；细胞凋亡检测试剂盒(Cell Death Detection ELISA kit)(Roche公司)；IL-6和TNF-α ELISA试剂盒(R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7细胞的培养： 将RAW264.7细胞置于含10%胎牛血清、100 mmol/L青霉素和100 mmol/L链霉素的DMEM培养液中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每1～2 d传代1次。

1.2.2 构建结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞模型： RAW264.7细胞复苏后传2～3代，待增殖至70%～80%汇合，按照感染复数(MOI=细菌数:细胞数)为10:1加入BCG菌悬液，轻轻摇匀，置于细胞培养箱中37 ℃、5% CO2孵育。感染4 h后更换新鲜培养基，24 h后收获。细胞模型分为4组：未处理组(未经BCG处理组)、对照组(BCG处理组)、mock+BCG组(BCG处理+阴性对照)、ANXA1+BCG组(BCG处理+ANXA1过表达)。

1.2.3 RT-qPCR检测mRNA表达: 用Trizol法分别提取各组细胞的总RNA，分光光度法测定并计算提取的总RNA浓度。将各组细胞总RNA反转录成cDNA，按照反转录试剂盒说明进行操作。参照SYBR Green PCR Kit试剂盒说明书进行实时定量PCR检测ANXA1及IL-6和TNF-α的mRNA表达。根据2-ΔΔCt法对结果进行分析。以GAPDH作为内参。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.4 Western blot检测蛋白表达： 分别收集各组细胞，用细胞裂解液RIPA提取总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度。取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE分离，通过半干转印法转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶37 ℃封闭1 h，加入抗ANXA1、Bax、Bcl-2、caspase- 3、?劆?β-actin和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入HRP标记的相应二抗，室温摇动孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL化学发光显影。使用凝胶成像仪分析系统Quantity One分析目的蛋白条带和GAPDH或β-actin条带吸光度值，二者的比值为相对表达量。

1.2.5 ELIAS分析炎性因子含量： 按照ELIAS检测试剂盒说明书检测收集到的细胞上清液中的IL-6和TNF-α的含量。用酶标仪测定在波长450 nm处的吸光值(A值)，根据标准品的浓度以及对应的A值计算样品浓度。

1.2.6 MTT检测细胞存活率： 用MTT试剂盒检测各处理组细胞的存活率。将RAW264.7细胞加入到96孔板中培养，根据试验设计处理细胞，培养24 h。培养结束前4 h每孔加入MTT溶液50 μL，置培养箱继续抚育。4 h后吸出上清液，每孔加150 μL DMSO，震荡摇匀，使用酶标仪检测490 nm波长处的吸光度值。

1.2.7 ELISA检测细胞凋亡： 将RAW264.7细胞以5×105个/mL接种于6孔板培养皿中，按试验设计处理后24 h，用细胞凋亡ELISA检测试剂盒进行检测，参照说明书进行操作。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BCG感染巨噬细胞对ANXA1表达的影响

巨噬细胞RAW246.7经BCG感染后，ANXA1的mRNA表达在48 h内逐渐降低(P<0.05)(图1A)；ANXA1蛋白表达水平显著下降(P<0.05)(图1B)。

2.2 ANXA1抑制BCG诱导的炎性应答进程

ANXA1过表达转染效率如图2A-B所示，ANXA1的表达水平明显上调。BCG感染的RAW246.7细胞中，IL-6和TNF-α的表达水平均显著增加(P<0.05)，ANXA1过表达明显抑制BCG感染诱导的巨噬细胞中IL-6和TNF-α表达(P<0.05)(图2)。此外，过表达ANXA1明显下调BCG刺激诱导的IL-6和TNF-α的mRNA表达(P<0.05)(图2B)。

2.3 ANXA1抑制BCG诱导的巨噬细胞凋亡

BCG感染后细胞的存活率显著降低；而过表达ANXA1后存活率有所增加(P<0.05)(图3A)。BCG处理后细胞凋亡率明显上升；而ANXA1过表达明显降低BCG感染后的细胞凋亡率(P<0.05)(图3B)。

A.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression ofANXA1; B.the protein expression of ANXA1 was determined by Western blot analysis;*P<0.05 compared with 0 hour

A, B.the transfection efficiency of ANXA1 was determined by RT-qPCR and Western blot; C.the level of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α were measured by ELISA assay; D.the mRNA expression ofIL-6 andTNF-αwas assayed by RT-qPCR;*P<0.05 compared with untreated;#P<0.05 compared with mock+BCG

A.the cell viability was detected by MTT assay; B.ELISA was carried out to determine cell apoptosis;*P<0.05 compared with untreated;#P<0.05 compared with mock+BCG

2.4 ANXA1对BCG感染的巨噬细胞中凋亡相关蛋白的影响

巨噬细胞RAW246.7经BCG感染后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低，促凋亡蛋白Bax及caspase- 3蛋白表达有所升高(P<0.05)(图4)；而过表达ANXA1则明显增高Bcl-2的表达，同时伴随Bax与caspase- 3的下调(P<0.05)(图4)。

the protein expression of caspase- 3, Bax and Bcl-2 was detected by Western blot analysis, and quantitative analysis；*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with mock+BCG

3 讨论

巨噬细胞在M.tb诱导的免疫反应中起重要作用。当机体感染M.tb时，首先激活巨噬细胞以清除M.tb，阻止其体内播散，并促进细胞因子TNF-α、IL-6等的释放，增强机体对M.tb的杀伤能力[8]。因而，建立分枝杆菌感染细胞模型对于深入研究炎性应答及细胞凋亡在M.tb感染免疫中的作用是必要的。本实验选择牛型结核分枝杆菌减毒株BCG作为感染菌株，以期了解ANXA1在BCG感染巨噬细胞RAW246.7的过程中对炎性反应及凋亡介导的免疫效应的影响，为进一步研究参与ANXA1调节炎性应答进程及凋亡的机制提供一定实验依据。

细胞因子在M.tb感染的巨噬细胞中的各个环节发挥重要作用，是目前结核免疫研究的热点领域之一[9-10]。巨噬细胞吞噬结核菌后，会启动IL-6和TNF-α介导的细胞凋亡，巨噬细胞发生凋亡，防止结核菌在体内扩大感染。本研究结果显示巨噬细胞RAW246.7经BCG刺激后，显著诱导促炎细胞因子IL-6和TNF-α的含量，而ANXA1过表达能够下调BCG诱导的炎性因子表达水平，从而推测ANXA1可抑制BCG感染巨噬细胞引发的炎性应答进程。

巨噬细胞的凋亡在其抗结核分枝杆菌感染过程中的作用呈现复杂性和和多面性。巨噬细胞诱导自身凋亡是杀伤M.tb限制其在体内播散的重要机制之一[11-12]。本研究结果揭示ANXA1可提高BCG感染的巨噬细胞的存活率，降低其凋亡率，可上调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时下调促凋亡蛋白Bax的表达水平，并降低了caspase- 3的蛋白表达量。上述结果揭示ANXA1通过上调感染后巨噬细胞中Bcl-2的表达水平、下调Bax表达水平，并依赖caspase- 3途径的凋亡程序，抑制BCG诱导巨噬细胞凋亡。

综上所述，ANXA1在BCG刺激诱导的巨噬细胞中具有抗炎及抗凋亡作用，在宿主免疫调节中具有重要调控作用，这为进一步探究结核病致病机制提供新的理论依据，同时亦为寻找新的结核病干预靶点及结核病临床诊断和治疗提供新的策略。