NR5A2减弱雨蛙素诱导大鼠胰腺腺泡细胞的炎性反应

徐志刚，郑 帅，杨泽冉，陈 雪，肖鲁瑶，孙亚梅，张 杰*

(首都医科大学附属北京安贞医院 1.消化内科； 2.北京市心肺血管疾病研究所 心血管生物研究室，北京 100029；3.首都医科大学附属北京友谊医院 放射介入科， 北京 100050)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种高发病率的临床疾病，其易发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis， SAP)，具有高病死率，是广受关注的临床疾病[1-4]。在胰腺炎过程中，胰腺细胞坏死与修复之间的平衡是一个中心问题。胰腺细胞凋亡可减少坏死，并有助于损伤修复[5-6]。但是具体调控机制尚不完全明确。

NR5A2是一个孤儿核受体，是NR5A亚家族的4个成员之一。NR5A2在胰腺组织中特异性表达，在维持细胞稳定性、细胞分化和细胞损伤修复起着重要的作用[7-8]。既往研究表明，在胰腺上皮细胞中选择性地失活NR5A2等位基因，足以引起胰腺炎[9]。这表明NR5A2可能参与急性胰腺炎的调控。具体机制方面，有研究发现，在肠黏膜上皮细胞中，NR5A2协同β-catenin调控周期蛋白基因的表达，促进肠黏膜上皮细胞损伤的修复[10]，然而，在胰腺腺泡细胞中是否存在类似机制尚不清楚。在本研究中，用雨蛙素刺激AR42J细胞建立急性胰腺炎模型，来检测NR5A2在大鼠胰腺腺泡细胞系炎性反应应激条件下的功能及与β-catenin信号通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞系(ATCC公司)；胎牛血清、RPMI-1640完全培养基(Corning公司)；雨蛙素(Sigma-Aldrich公司)；NR5A2 shRNA、β-catenin shRNA、EndoFectin转染试剂、Opti-MEM、IL-1 Elisa试剂盒和TNF-α ELISA试剂盒(GeneCopopia公司)；过表达NR5A2慢病毒及其对照病毒、Polybrene(Hanbio公司)；AV/PI凋亡检测试剂盒(BD公司)；细胞总蛋白提取试剂盒(Merck Millipore公司)；BCA蛋白质定量试剂盒和β-actin鼠源一抗(Ythxbiotech公司)；NR5A2兔源一抗和β-catenin兔源一抗(Abgent公司)；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(LI-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞系培养：用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液置于37 ℃、5% CO2温箱中培养AR42J 细胞，培养基每1 ～ 2 d更换1次。当细胞增殖到75%～85%汇合度时进行传代培养。

1.2.2 慢病毒过表达NR5A2：用24孔培养皿，每孔接种5×104个细胞，用含10%胎牛血清的1640培养液培养24 h，使感染时的细胞数约为8×104个/孔。向含5%灭活血清1640培养基中加入polybrene，使polybrene的最终浓度为5.0 mg/L。然后弃去24孔培养皿中的旧液，每孔加入24 μL慢病毒颗粒原液，慢病毒滴度为1×108TU/mL和476 μL上述培养基。同时，用空质粒转染细胞，作为阴性对照组。轻轻混匀，细胞在37 ℃、5% CO2条件下培养12 h后，更换为正常培养液。48 h后荧光显微镜下观察细胞感染率。蛋白免疫印迹验证NR5A2在蛋白水平的表达量。

1.2.3 用shRNA分别沉默NR5A2和β-catenin：针对大鼠NR5A2和β-catenin靶基因，分别用化学合成的含eGFP标记的NR5A2 shRNA和含mcherryFP标记的β-catenin shRNA转染AR42J细胞，转染试剂为EndoFectin。细胞铺6孔板，每孔5.0×105个细胞，24 h后转染，转染时每孔培养液体积为500 μL。在离心管中加入12.5 μL EndoFectin、125 μL Opti-MEM混匀。在另一离心管中加入DNA量为3 000 ng的质粒和Opti-MEM 125 μL混匀。室温静置5 min，充分混匀两管中的溶液，室温静置20 min，形成 DNA-EndoFectin复合物。向每孔细胞中加入DNA-EndoFectin复合物，并轻轻涡旋培养板，转染3 h后，添加1 mL含10%血清的培养液，5% CO2、37 ℃孵育，48 h后观察有无荧光。

1.2.4 胰腺炎细胞模型的构建：将AR42J细胞接种到6孔板，接种细胞为1×106个/孔，经过24 h的培养达到60% ～ 70%的汇合度，用100 nmol/L的雨蛙素刺激细胞后，收取细胞，流式细胞计量术检测细胞的凋亡率。收取细胞上清，ELISA检测上清中炎性因子浓度。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率：用AV/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。把AR42J细胞接种到6孔板中，使每孔细胞达1×106个。在24 h后，更换新的培养基，每孔细胞分别用100 nmol/L雨蛙素处理2、4、6和8 h。以磷酸盐缓冲液(PBS)处理的细胞作为对照。用预冷的PBS洗涤细胞2次，轻轻吹打并收集细胞，于800 r/min离心5 min，用预冷的1×结合缓冲液重悬细胞1次，然后添加5 μL的annexinV-FITC混匀后，再加入5 μL的PI染色，避光，室温孵育15 min，上机前5 min，补加200 μL 1×结合缓冲液。

1.2.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中的炎性因子：将AR42J细胞接种到6孔板中，每孔细胞数为1×106个。24 h后，培养基被移除，用100 nmol/L雨蛙素分别刺激1、2、4、6和8 h后收取上清。分别按照IL-1、TNF-α ELISA试剂盒操作步骤检测细胞上清中各自的表达水平。

1.2.7 蛋白质提取和免疫印迹电泳检测NR5A2和β-catenin含量：用细胞总蛋白提取试剂，细胞裂解液中加入PMSF，比例为100∶1，提取细胞总蛋白。按照BCA蛋白质定量试剂盒操作说明进行蛋白质浓度测定，每孔蛋白样本上样量为30 μg，进行SDS-PAGE电泳及转膜，一抗NR5A2抗体(1∶500)、β-catenin抗体(1∶500)、β-actin抗体(1∶1 000)相应比例稀释后于4 ℃孵育过夜，荧光二抗室温避光孵育1 h。用LI-COR Odyssey红外荧光成像系统分析条带吸光度值，用β-actin条带吸光度值校正，得到各条带相对吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 雨蛙素刺激引起AR42J细胞炎性反应和凋亡，并抑制NR5A2水平

用100 nmol/L雨蛙素刺激AR42J细胞可时间依赖性地诱导AR42J细胞凋亡，刺激6 h的细胞凋亡率达到峰值(图1A，B)。相应的，细胞上清中的TNF-α和IL- 1的水平在各时间点均明显高于对照细胞组，在6 h达最高水平(图1C)。随着雨蛙素刺激时间的变化，NR5A2先降低后升高，24 h达最低水平，48 h后逐步恢复正常水平(图1D)。

2.2 过表达NR5A2促进炎性反应应激条件下的细胞凋亡，且减轻细胞炎性反应

与慢病毒空载体感染的对照组相比，感染携带NR5A2慢病毒的细胞NR5A2蛋白含量显著升高(图2A)。NR5A2过表达组的细胞凋亡率显著增加(图2B)，细胞上清中炎性因子IL-1和TNF-α的浓度显著降低(图2C)。

2.3 沉默NR5A2抑制炎性反应应激条件下的细胞凋亡，且加重细胞炎性反应

与用scramble shRNA的对照组相比，沉默NR5A2组细胞的NR5A2蛋白表达量显著降低(图3A)，细胞凋亡率显著降低(图3B)，细胞上清中炎性因子IL-1和TNF-α的浓度显著升高(图3C)。

2.4 β-catenin信号通路参与NR5A2介导的细胞凋亡和炎性反应

与用β-catenin scramble shRNA转染的对照组相比，沉默组β-catenin蛋白质含量显著降低(图4A)，细胞凋亡率显著降低(图4B)，同时细胞上清中IL-1和TNF-α炎性因子的浓度显著增高(图4C)。

3 讨论

急性胰腺炎是一种高发病率的临床疾病，发病机制尚不完全明确。NR5A2在胰腺腺泡细胞中特异性表达，可以激活一系列特定的基因，与细胞的损伤修复和稳定性密切相关，参与胰腺外分泌功能的恢复[11]。同时，有报道在小鼠急性胰腺炎模型中，腺泡细胞中NR5A2会出现瞬间下调[8]；特异性地删除胰腺NR5A2则会使小鼠胰腺炎模型的腺泡细胞修复不良、发生坏死，单倍体不足的胰腺炎小鼠SAP会加重[9]。这些报道提示NR5A2可以促进胰腺细胞的修复。

A.representative flow cytometry graphs of apoptosis tests; B.statistic graph of apoptosis rate; C.levels of IL-1 and TNF-α in cell culture medium supernatant; D.representative Western blot graph of NR5A2 (Value of NR5A2/β-actin: 0 hour, 0.402±0.197; 2 hours, 0.364±0.245; 4 hours, 0.350±0.228; 8 hours, 0.344±0.205; 12 hours, 0.324±0.195; 24 hours, 0.312±0.193; 48 hours, 0.375±0.164);*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

图1雨蛙素刺激引起AR42J细胞凋亡和炎性反应，并下调NR5A2水平

在具体的修复功能方面，鉴于既往研究证实，受损伤腺泡细胞的凋亡有利于胰腺组织的修复，细胞的凋亡率与SAP的严重程度呈负相关[12]；同时，诱导细胞凋亡后，IL-1 mRNA在胰腺组织的水平很低，表明诱导细胞凋亡后炎性反应被抑制[6]，因此促进凋亡可能会减弱胰腺炎的严重性。为验证这一潜在作用机制，本研究采用在胰腺炎腺泡细胞中过表达NR5A2的方法，发现NR5A2过表达能促进胰腺炎腺泡细胞凋亡，抑制IL-1、TNF-α炎性因子的产生，提示NR5A2通过促进凋亡抑制炎性反应，对胰腺腺泡细胞起保护作用。

NR5A2在急性胰腺炎中诱导胰腺细胞凋亡的下游信号分子仍不清楚。有报道，NR5A2可以直接与Wnt /β-catenin信号通路相互作用，从而促进肠道上皮细胞损伤的修复[10, 13]。而Wnt信号通路参与了细胞增殖、分化、凋亡、迁移和干细胞自我更新的调控[14]，并在炎性反应中起着关键的作用[15]。因此本研究着眼于Wnt /β-catenin信号通路，发现在过表达NR5A2的细胞中，通过抑制β-catenin表达，会使细胞凋亡减少并且炎性细胞因子(IL-1、TNF-α)增加，证实在胰腺炎中，β-catenin可能介导NR5A2在腺泡细胞炎性反应应激条件下的调节作用。

A.Western blot graph and statistic result of NR5A2 after lentivirus vectors infection; B.flow cytometry graph and statistic result of apoptosis rate after lentivirus vectors infection; C.levels of IL-1 and TNF-α in cell culture medium supernatant after lentivirus vectors infection; LV-null.empty lentivirus vector; LV-NR5A2.lentivirus vector carrying NR5A2 gene;*P<0.05,**P<0.01 compared with LV-null group

图2慢病毒载体在AR42J细胞中过表达NR5A2促进细胞凋亡并抑制炎性因子水平

综上所述，本研究结果证明了NR5A2在保护胰腺细胞、减少炎性反应损伤中起着重要的作用，β-catenin信号通路参与了NR5A2的上述作用。然而，NR5A2如何调控Wnt /β-catenin信号通路起作用仍然不清楚，有待进一步研究。此外，NR5A2的保护作用有待在动物模型水平上进一步的验证。

A.Western blot graph and statistic result of NR5A2 after NR5A2 shRNA transfection; B.flow cytometry graph and statistic result of apoptosis rate after NR5A2 shRNA transfection; C.levels of IL-1 and TNF-α in cell culture medium supernatant after NR5A2 shRNA transfection; Scr sh-RNA.scramble shRNA; NR5A2 sh-RNA.shRNA which targeted NR5A2；*P<0.05,**P<0.01 compared with scramble shRNA group

图3shRNA在AR42J细胞中抑制NR5A2下调细胞凋亡并上调炎性因子水平

A.Western blot graph and statistic result of β-catenin after shRNA transfection; B.flow cytometry graph and statistic result of apoptosis rate after β-catenin shRNA transfection; C.levels of IL-1 and TNF-α in cell culture medium supernatant after β-catenin shRNA transfection； Scr sh-RNA.scramble shRNA; β-catenin sh-RNA.shRNA which targeted β-catenin; LV-NR5A2.lentivirus vector carrying NR5A2 gene;*P<0.05,**P<0.01 compared with LV-NR5A2+scr sh-RNA group

图4shRNA在过表达NR5A2AR42J细胞中抑制β-catenin下调细胞凋亡并上调炎性因子水平