脂联素抑制高浓度胰岛素诱导的大鼠心肌细胞肥大

轩辕东，刘雅娟，任永康，徐 璐，朱 娜，杨锐英*

(1.宁夏医科大学 心血管内科，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学总医院 心血管内科，宁夏 银川 750004；3.宁夏医科大学总医院心脑血管病医院 心血管内科，宁夏 银川 750004；4.宁夏人民医院 心血管内科，宁夏 银川 750004)

正常人血液循环中脂联素(adiponectin，APN)含量与左心室体积和室壁厚度具有负相关性，推测APN可能参与了心肌细胞肥大过程[1]。高浓度胰岛素可诱导心肌细胞肥大[2]。APN通过与AdipoR1结合后可以激活AMPK及其下游的信号通路[3-4]，有报道PI3K/AKT可以作为AMPK下游的通路发挥作用[6]，因此，APN可通过AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT途径发挥作用。APN是否可以抑制高浓度胰岛素诱导的心肌细胞肥大鲜有报道。本研究通过构建高浓度胰岛素诱导的大鼠心肌细胞肥大模型，观察APN对高浓度胰岛素诱导的心肌细胞肥大的抑制作用及其机制，为治疗慢性心力衰竭提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级1～3日龄SD大鼠[购自宁夏医科大学实验动物中心，合格证号:SCXK(宁)2015-0001]。慢病毒(上海吉凯基因化学技术有限公司)；胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶、DMEM和5-溴脱氧尿核苷(Sigam公司)；胎牛血清(Gibico公司)；总蛋白提取试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏凯基生物科技技术有限公司)；兔抗大鼠E-53/ AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠心肌细胞的培养及分组：体外分离大鼠心肌细胞，调整至适当浓度后接种于细胞培养皿中进行培养；将细胞分为4组：1)对照组：第1～6天使用完全培养基培养，第7天更换为基础培养基培养1 d，基础培养基继续培养2 d；2)模型组：前7天与正常对照组处理相同，第8天用1×10-6mol/L胰岛素处理2 d；3)干预组：前7天与正常组处理相同，第8天用胰岛素+7.5 mg/L脂联素处理2 d； 4)转染组：第1～3天使用完全培养基培养，第4天进行转染，转染12 h后更换完全培养基培养至第6天，此后用基础培养基培养1 d，胰岛素+脂联素处理2 d。各组分别培养至第9天收集样本进行心肌细胞蛋白含量、3-甲基组氨酸(3-methyl histidine，3-MH)、细胞表面积、AdipoR1、AMPK、PI3K及AKT蛋白表达含量的检测。

1.2.2 细胞表面积的测定: 将细胞悬液接种于24孔板中的盖玻片上，培养干预后制成细胞爬片。用4%多聚甲醛固定细胞 20 min，0.1% Triton X-100透化5 min，1% BSA封闭1 h，E-53(1∶1 000)室温孵育1 h，荧光兔二抗(1∶2 000)避光孵育1 h。DAPI 染核 5 min，荧光显微镜下观察并摄片。Image-Pro Plus软件分析计算细胞表面积。

1.2.3 心肌细胞转染：实验前1天，将(3～5)×105细胞/孔接种至6孔板内，每孔2 mL培养基。吸去原培养基，每孔加入 MOI=50的病毒体积。放入孵箱进行培养12 h后换完全培养基继续培养。

1.2.4 Western blot检测蛋白表达水平: 用0.25%胰蛋白酶消化离心收集细胞，RIPA裂解液裂解细胞收集蛋白，BCA法测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离、电转至PVDF膜，10%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗AdipoR1、PI3K(1∶1 000)、AMPK、AKT(1∶500)于4 ℃孵育过夜，IgG兔二抗(1∶5 000)于37 ℃孵育1 h，ECL显色。以GAPDH作为内参照。显影条带用软件Gelpro32分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组心肌细胞肥大情况

与对照组比较，模型组细胞表面积明显增大(P<0.01)，与模型组比较，干预组心肌细胞相对表面积回降(P<0.01)(图1)；与干预组比较，转染组心肌细胞表面积增大(P<0.01)(图1)。

2.2 各组心肌细胞蛋白含量及3-MH释放

与对照组相比，模型组细胞蛋白含量增加(P<0.05)；与模型组比较，干预组细胞蛋白含量回降(P<0.05)；与干预组比较，转染组细胞蛋白含量增加(P<0.05)。与对照组相比，模型组3-MH释放量显著减少(P<0.01)；与模型组比较，干预组3-MH释放量明显回升(P<0.01)；与干预组比较，转染组3-MH释放量显著减少(P<0.01)(表1)。

2.3 各组心肌细胞AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT蛋白的表达水平

与对照组相比，模型组AMPK、PI3K和AKT表达减少(P<0.05)；与模型组相比，干预组AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT表达增加(P<0.05)，转染组AdipoR1表达相对减少(P<0.05)；与干预组相比，转染组AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT明显降低(P<0.05)(图2，表2)。

3 讨论

APN与心室肥厚呈反比关系[6-8]，外源性APN可以改善胰岛素抵抗导致的大鼠心室肥厚[9]。在体实验研究由于受多种因素影响，不能有效反映APN在改善心室重构中的作用。本实验用高浓度胰岛素诱导的心肌肥大细胞可更直观观察APN对高浓度胰岛素诱导的大鼠肥大心肌细胞的作用。3-MH是存在于心肌细胞蛋白中的一种转录后修饰的氨基酸[10]，由于缺乏特异性的tRNA，心肌细胞蛋白质分解代谢时所释放的3-MH不能参与新蛋白质的合成，因此，可以作为心肌细胞蛋白质降解的生物学标志。本研究发现：高浓度胰岛素可使大鼠心肌细胞蛋白含量及细胞表面积明显增加，3-MH释放量减少，表明高浓度胰岛素可以诱导心肌细胞肥大[1]。有研究表明，胰岛素与胰岛素样生长因子有较高的同源性[1]，可结合胰岛素样生长因子受体促进心肌细胞的蛋白合成速度及增加蛋白含量，导致心肌细胞肥大。胰岛素也可能是通过与相应受体结合后通过上调心肌营养素-1的表达来实现这种作用[11]。

△P<0.01 compared with model;#P<0.01 compared with intervention

图1 各组心肌细胞表面积Fig 1 Surface area of cardiomyocytes in each

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with model.

A.control group; B.model group; C.intervention group; D.transfection group图2 各组 AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT蛋白表达Fig 2 Protein expressions of AdipoR1, AMPK, PI3K and AKT in each group

groupAdipoR1AMPKPI3KAKTcontrol0.82±0.020.83±0.020.82±0.021.04±0.03model0.81±0.020.75±0.02*0.61±0.02*0.22±0.02*intervention1.24±0.04#1.15±0.03#1.16±0.04#0.52±0.02#transfection0.65±0.040.75±0.020.60±0.020.22±0.01

*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with model.

siRNA可以针对性选择RNA双链中的一条链进行重组，导致mRNA降解，从而限制特定基因的表达。本实验使用AdipoR1 siRNA 转染心肌细胞，发现它可以明显降低心肌细胞AdipoR1的表达，由于AdipoR1是APN在心肌细胞发挥作用的必要条件，因此AdipoR1 siRNA可在一定程度上阻断外源性APN的生理作用。

APN是否具有抑制高浓度胰岛素诱导的心肌细胞肥大作用，尚不明确。本实验发现APN可以使心肌细胞蛋白含量及细胞表面积减小，3-MH释放量增加，提示APN在一定程度上可以抑制高浓度胰岛素诱导的心肌细胞肥大。APN与AdipoR1相结合后有胰岛素增敏和抗炎等作用[12]。用APN干预大鼠的趾长伸肌时观察到APN与其受体结合后可活化AMPK[13]。有报道在乳腺癌细胞中发现APN及其受体活化AMPK，最终放大了PI3K传导信号，提示PI3K/AKT可作为AMPK下游通路发挥对细胞的调节作用。关于APN抑制高浓度胰岛素诱导的心肌细胞肥大的机制国内外鲜有研究，本实验发现外源性APN干预可以使心肌细胞中的AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT蛋白表达明显增加，表明APN可能是通过上调AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT的方式来抑制高浓度胰岛素诱导的心肌细胞肥大。本实验用AdipoR1 siRNA沉默AdipoR1的表达，阻断APN的作用后发现心肌细胞中的AdipoR1、AMPK、PI3K和AKT蛋白表达均未发生明显变化，进一步提示AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT是APN抑制高浓度胰岛素诱导心肌细胞肥大的途径之一。

综上所述，APN可通过上调AdipoR1/AMPK/PI3K/AKT途径抑制高浓度胰岛素所诱导的心肌细胞肥大。