感染病毒宠物犬肠道细菌的初筛与耐药性分析

柴贝贝，黄华旭，姜维佳，王莉贞，胡 梅，赵雨川，吴永继，吴显实，司红彬

(广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005)

犬猫皮肤病、伤口感染、外耳道炎、呼吸系统感染和泌尿道感染等都是临床中常见的需要用抗菌药物治疗的疾病[1]。另外，在由病毒性疾病诱发的细菌性感染治疗时，也需要使用抗菌药进行消炎[2]。犬细小病毒和犬冠状病毒是较为常见的犬致病性病毒，两者均易感染幼龄犬，且都能引起犬的胃肠道疾病，临床上以频繁腹泻、呕吐、脱水、精神沉郁等为主要特征[3-4]。在这2类病毒性疾病的治疗上，一般先是及时给于足量的特异性抗体，同时用免疫增强剂和中、西医抗病毒类药物配合治疗以控制病情的发展及恶化，然后是用头孢类药进行抗菌消炎，最后是进行对症治疗，如用氯丙嗪止吐，用 0.1% 高锰酸钾溶液清洗肠道等[2]。

有调查显示，加拿大犬的大肠杆菌对头孢菌素类的耐药率由61%上升至86%，对阿莫西林耐药率由67%上升至85%[5]。另有研究指出，宠物源细菌的耐药性与抗生素的使用有很大关系，如美国一家兽医院调查了泌尿道感染犬体内大肠杆菌对恩诺沙星的耐药率，发现耐药率的增高与该医院恩诺沙星使用量的增加之间呈正相关[1]。芬兰的学者通过对有过抗菌药治疗的慢性皮肤病患犬与无用药史的犬身上的葡萄球菌耐药率进行比较，发现用药犬的葡萄球菌对磺胺/TMP的耐药率(57%)明显高于未用药犬的耐药率(25%)，且多重耐药性更普遍(29% ∶9%)[6]。目前，国内对于宠物源细菌耐药性的研究大多在大肠杆菌[7]、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、铜绿假单胞菌[8]等，且已发现这些细菌均存在不同程度的耐药性，而细小病毒和冠状病毒是常见的宠物易感染的病毒，关于感染病毒犬经抗生素治疗后其肠道细菌的种类和耐药性调查还鲜有报道，本研究旨在以此次分析结果为依据，以期提高对宠物病毒性疾病治疗时抗菌药合理使用的关注和重视。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 从广西大学动物医院接诊的细小病毒感染犬、冠状病毒感染犬和在动物医院饲养的健康犬采集的肛门拭子。

1.1.2 药品及培养基 药品：头孢曲松钠、阿莫西林、环丙沙星、左旋氧氟沙星、磷霉素、黏杆菌素、恩诺沙星、乙酰甲喹、克林沙星、磺胺间甲氧嘧啶、加替沙星、阿米卡星、头孢他啶、林可霉素、头孢噻呋钠、氟苯尼考、阿奇霉素、头孢噻肟钠、利福平、美罗培南，均购自广西万丰药业有限公司，均为国产药品，且在有效期内。

培养基及其他：普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、麦康凯培养基、沙门志贺菌属(SS)培养基，以及革兰氏染液、肠杆菌科细菌生化鉴定管，均购自杭州天和微生物试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 将样品接种于普通肉汤中，37 ℃振荡培养12 h，再取培养物分别划线接种于普通琼脂培养基、麦康凯培养基、SS培养基，37 ℃恒温培养12 h，之后挑取单个纯菌落分别接种于普通肉汤中，37 ℃振荡培养6 h，再划线接种于对应培养基中进行纯培养，重复此步骤，直至琼脂培养基上完全呈现纯种菌落。

1.2.2 细菌革兰氏染色镜检 从完全呈现出纯种菌落的琼脂板上，挑取菌落，经革兰氏染液染色后，进行镜检。

1.2.3 细菌的生化鉴定 取镜检结果为革兰氏阴性菌的菌落，依次接种于系列细菌生化鉴定管中，于37 ℃恒温培养相应时间。

1.2.4 细菌耐药性的测定 采用2倍微量稀释法测定供试药对各分离细菌的最小抑菌浓度(MIC)，具体操作参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的方法和结果判定标准[9]。耐药率=细菌的耐药数/受试药总数×100%。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离鉴定结果

经系列基础培养基、选择培养基的培养分离，革兰氏染色镜检出9株革兰氏阴性菌，1株革兰氏阳性菌；将9株革兰氏阴性菌进行生化鉴定，得到9株肠杆菌科细菌，分别为来自感染细小病毒犬的疑似弗劳地氏枸橼酸杆菌1株、疑似大肠埃希氏菌1株；来自感染冠状病毒犬的臭鼻克雷伯氏菌1株、大肠埃希氏菌2株、疑似大肠埃希氏菌1株；来自健康犬的大肠埃希氏菌3株(表1)。

2.2 细菌耐药性结果

由表2可知，从各细菌的最小抑菌浓度(MIC)可以看出从细小病毒感染犬肠道内分离的疑似大肠埃希氏菌1的耐药率最高，达到90%；其次是从冠状病毒感染犬肠道内分离的1株大肠埃希氏菌1、从健康犬肠道内分离的1株大肠埃希氏菌4，两者的耐药率达到了80%，然后是从冠状病毒感染犬肠道内分离的1株大肠埃希氏菌2和1株臭鼻克雷伯氏菌的耐药率均为75%，最后是分别从细小病毒感染犬、冠状病毒感染犬、健康犬肠道内分离的疑似弗劳地氏枸橼酸杆菌、疑似大肠埃希氏菌2、2株大肠埃希氏菌(大肠埃希氏菌3、大肠埃希氏菌5)，耐药率分别为40%、50%、45%、50%。

表1 9株革兰氏阴性细菌生化鉴定结果

注：“+”表示结果为阳性，“-”表示阴性。

表2 从不同犬分离细菌的MIC μg/mL

注：“-” 表示细菌对受试抗生素敏感。

3 讨论与结论

随着人们生活水平的提高和对宠物重视程度的加深，对宠物医疗方面的投入也越来越大，在治疗时会使用很多人用抗生素，再加上宠物从业人员水平的限制和受利益的驱使，在不进行病原菌分离鉴定和药敏试验的情况下，就盲目使用抗生素治疗，以追求治疗效果的快速和明显[10]。统计数据表明，在瑞典从2000—2005年，在犬疾病治疗时，头孢菌素类药的用量增加了220%[11]；而在丹麦，仅2006年宠物的抗菌药用量就高达2 t，其中占兽医临床抗菌药总用量50%以上的就是氟喹诺酮类药[12]，这些抗菌药的大量使用，大大增加了宠物源细菌耐药性产生和增强的可能性。

宠物和人频繁亲密接触，使得宠物细菌传播给人的可能性增大，狗和猫携带的人兽共患病病原菌可通过粪-口途径、皮肤外伤(犬咬伤或猫抓伤)或媒介昆虫传播给人。2006年，在美国有1病例报道，从被抗菌药治疗过的犬咬伤后的宠物主人体内分离到多重耐药的大肠杆菌和肠球菌[13]。Rodrigues通过Eric-PCR方法证实从1名3岁儿童分离的大肠杆菌和从他家腹泻犬体内分离的大肠杆菌完全一样[14]。已有的实例和目前大量的调查研究数据都表明很多细菌已在人和动物之间传播，若不加以控制，这将会对公共卫生安全产生极其恶劣的影响。

2013年，哈尔滨地区的1项对宠物源大肠杆菌耐药性调查显示，所分离的宠物源大肠杆菌耐药情况较严重，且多重耐药菌株的检出率高达71.95%[15]。而从本调查结果也可看出，病毒感染犬和健康犬，其肠道细菌的耐药性较强，且对多种常用抗生素如头孢类、阿莫西林、磺胺类、氟苯尼考、氟喹诺酮类不敏感，呈现多重耐药性。经了解，此次病毒感染犬接受过恩诺沙星和阿米卡星1周的治疗，但从其所分离细菌的耐药性来看，疑似弗劳地氏枸橼酸杆菌对这2种抗生素均敏感，从冠状病毒感染犬肠道内分离的2株大肠埃希氏菌不完全对这2种抗生素具有耐药性，而健康犬肠道内的1株大肠埃希氏菌对这2种抗生素均具有耐药性，从这些结果可以看出，细菌耐药性的产生可能与治疗时间、动物个体因素等有关。近年来，人源弗劳地氏枸橼酸杆菌的检出率越来越高，比如其引起食物中毒[16]及各种感染[17]的报道，但动物源弗劳地氏枸橼酸杆菌的检出率不高，仅有个别报道称弗劳地氏枸橼酸杆菌引起猕猴腹泻[18]和中华鳖“大脖子”病[19]，另有报道在动物园的动物舍内外环境中分离到致病性臭鼻克雷伯氏菌[20]，而此次从宠物犬肠道内检出了这2种细菌，且检测出其具有一定的耐药性，更进一步提示在动物病原分析时应关注这2种细菌的必要性。段会勇的研究表明，鸡舍内环境中的大肠杆菌可以通过舍内外气体的交换而传播到舍外环境中去[21]，因此不难解释在同一环境下，健康犬肠道细菌的耐药性跟病毒感染犬的肠道细菌耐药性具有一定的相似性。另外，应当引起重视的是，所分离细菌中，有4株是耐美罗培南株，而徐建铭等研究显示，肠杆菌科细菌对美罗培南的耐药率极低，大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌对美罗培南的耐药率均为0[22]。2个研究结果的差异提示宠物中可能已出现美罗培南耐药株，宠物出现耐碳青霉烯类药物的菌株必将带来严重的公共卫生问题。药敏结果显示，所分离细菌对临床常用抗生素均存在一定耐药性，这些细菌耐药结果的不统一，初步表明了当前宠物细菌耐药情况的复杂，也为临床用药的选择增加了难度。

本研究结果表明感染病毒犬经抗生素治疗后，其肠道细菌的种类和耐药性均较健康犬严重，故在动物感染病毒后其机体抵抗力降低的情况下，引发细菌继发性感染后，此类的细菌耐药性调查应和其他的创伤感染、皮肤感染、胃肠道感染区分开，增加病原检出种类，才可以更好地为宠物疾病的临床治疗提供合理依据。