脂氧素类似物BML-111对炎症状态人单核细胞株U937氧化应激标志物表达的影响

郝建，郝华，徐芬，徐静，张建，李里香，曾磊

(1蚌埠市第三人民医院，安徽蚌埠233000；2南昌大学第二附属医院)

败血症是重症医学科的常见病症，临床表现为全身系统性炎症应答，可由细菌感染或外伤引起，最常见的病因为革兰阴性菌中的脂多糖(LPS)刺激。败血症发生的病理生理过程中常伴有肿瘤坏死因子α(TNF-α)的大量释放，引起细胞和组织的过度氧化应激，造成细胞和组织的广泛损伤。核因子E2相关因子2(Nrf2)参与炎症的启动、发生发展过程及氧化应激的调控过程[1～3]。Nrf2作为氧化还原反应中的关键酶，调控了抗氧化反应元件和其下游所编码的很多二期解毒酶和抗氧化酶，其中包括醌氧化还原酶(NQO1)、血红素加氧酶1(HO-1)等。单核-巨噬细胞在败血症及肿瘤等诸多病理过程中扮演重要角色。LPS可诱导单核细胞内HO-1表达增加。前期研究[4～6]结果表明，脂氧素及其类似物BML-111在抗炎、促进炎症消退方面发挥重要作用。本研究以人单核细胞株U937为研究对象，以LPS模拟炎症模型，采用BML-111预处理U937细胞，观察BML-111对炎症状态U937细胞中氧化应激标志物表达的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 人单核细胞株U937购于中科院上海生化与细胞生物学研究所，用含20%胎牛血清、双抗的RPMI1640培养液培养，培养条件为5%CO2、37 ℃。当80%～90%的细胞融合时进行传代，取第3～5代细胞进行后续实验。RPMI1640干粉购于美国GIBCO公司。TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司。逆转录试剂、PCR扩增仪均购于美国MJ Research公司。兔抗人Nrf2抗体购于美国Santa Cruz公司。FITC荧光二抗(山羊抗兔)购于武汉博士德公司。BML-111购于美国Cayman公司。LPS购自美国Sigma公司。胎牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司。羟乙基哌嗪乙硫磺酸及L-谷胺酰胺、双抗均购于Amresco公司。PCR引物由上海赛百盛公司合成。

1.2 炎症细胞模型制作及BML-111给药方法 将U937细胞分为对照组、模型组、实验组。对照组不加入药物；模型组加入1 μg/L[7,8]的LPS制作炎症模型；实验组先加入200 μg/L[7]的BML-111预处理30 min后再加入1 μg/L的LPS。

1.3 各组细胞中Nrf2蛋白检测 将U937细胞接种于24孔板，待细胞生长融合至30%时按“1.2”中的分组进行给药，作用24 h后弃上清液，部分细胞即黏附于盖玻片上。用PBS冲洗2次，加入冰甲醇浆培养板放置在-20 ℃冰箱固定约10 min。用浓度为0.2%的Triton PBS洗2次，再用浓度为0.5%的Triton PBS破膜10 min，PBS冲洗5 min。采用浓度为5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭约40 min。加入Nrf2一抗后放置于4 ℃冰箱孵育4 h后，PBS冲洗3次、每次5 min，用FITC标记的荧光二抗在室温条件下孵育约1 h，最后用Hoechest33258染料染细胞核约15 min。在荧光显微镜下观察Nrf2的表达定位，拍照，采用Image J软件对荧光图片进行半定量分析，以荧光强度表示Nrf2的表达水平。每组实验均重复3次。

1.4 各组细胞中Nrf2、NQO1、HO-1、TNF-α mRNA检测 采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，逆转录为cDNA，进行PCR反应。以GAPDH为内参。PCR反应总体积为25 μL，其中包括12.5 μL的PCR混合液，5 mmol/L的上、下游引物各1 μL，1.5 μL的cDNA，其余用无菌水补足总体积。基因引物用Primer5.0软件设计，目的基因、内参基因的引物序列和相应的反应条件见表1。将上述样本放置在PCR扩增仪上进行扩增，产物用1.6%琼脂糖凝胶进行电泳，采用凝胶成像系统对条带进行半定量统计学分析。实验均重复3次。各目的基因的相对表达量以目的基因的拷贝数与GAPDH基因的拷贝数之比表示。

2 结果

对照组细胞中Nrf2蛋白主要定位于胞核与胞质；模型组细胞中Nrf2蛋白主要定位于胞核，即从胞质转位至核内；实验组Nrf2蛋白表达定位与对照组相近。对照组、模型组、实验组细胞中Nrf2蛋白相对表达量分别为1.000 0±0.065 57、2.223 3±0.080 21和0.973 3±0.045 09；模型组Nrf2蛋白相对表达量高于对照组，实验组Nrf2蛋白相对表达量低于模型组(P均<0.05)。模型组中Nrf2、NQO1、HO-1、TNF-α mRNA相对表达量高于对照组，实验组细胞中Nrf2、NQO1、HO-1、TNF-α mRNA相对表达量低于模型组(P均<0.05)。详见表2。

表1 目的基因、内参基因的引物序列及PCR反应条件

表2 各组U937细胞中Nrf2、NQO1、HO-1、TNFα mRNA表达比较

3 讨论

单核-巨噬细胞在炎症及肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色。巨噬细胞在致炎因子的作用下，发挥其氧化应激作用，目的是消除病原体、清除肿瘤细胞，维持机体内环境的稳定。但如果机体的炎症反应过强，势必造成细胞和组织的过度损伤，不利于组织修复。有学者认为肿瘤即是慢性炎症经久不愈的结果。因此，如何使炎症可控，如何使肿瘤组织中的炎症及时消退，成为当前炎症领域研究的热点。

氧化应激是指机体在一些有害因子的作用下，产生过多的活性氧簇(ROS)和活性氮自由基(RNS)，而机体的清除能力有限，从而导致氧化与抗氧化平衡被打破的病理过程。各种炎症过程特别是败血症(LPS引起)的发生涉及了氧化应激过程，其中发挥主要作用的是各种炎细胞包括单核细胞。败血症的促发因素有很多，主要包括细菌感染(内毒素释放)、缺血、缺氧等因素，其中细菌感染是最常见的病因。在氧化应激过程中，Nrf2发挥着调控功能。ROS能激活转录因子如Nrf2、NF-κB的表达。Nrf2作为氧化还原反应中的关键酶，调控抗氧化反应元件和其下游所编码的许多二期解毒酶和抗氧化酶，其中包括NQO1、HO-1等。脂氧素类似物BML-111在体内和体外实验中都表现出强大的抗炎和促炎症消退功能。前期研究[9]表明，脂氧素能缓解大鼠缺血缺氧性脑损伤。在大鼠体内实验中发现，BML-111能减轻肝损伤和肝纤维化[4,5]。脂氧素还能调控RAW264.7细胞的细胞周期[6]，而且在调节细胞间的免疫反应、抑制肿瘤等多方面发挥着重要作用[10,11]。新近研究[12]表明，脂氧素A4(LXA4)能明显抑制LPS诱导的HK2细胞的氧化应激。

本研究发现，在LPS的作用下，Nrf2蛋白及基因表达明显增强，意味着巨噬细胞内抗氧化酶系统增强。而在BML-111预处理后，U937细胞中Nrf2、NQO1、HO-1基因表达明显减弱，以促进细胞氧化应激，更好地发挥其氧化吞噬及抗炎功能。生理状态下，Nrf2与Keapl结合，在细胞内处于失活或抑制状态。而在外界刺激因素作用下，细胞内的Nrf2蛋白与Keapl蛋白发生分离，Nrf2蛋白转位至核内，这样Nrf2就可以与抗氧化反应元件ARE上的相应位点进行结合，从而启动下游酶的表达，发挥抗氧化功能[13～19]。NQO1是细胞内的一种黄素酶，可调节细胞的氧化还原状态，抑制氧化应激。HO-1蛋白的激活可由很多因素诱导，如内毒素、高热、缺氧等，对机体具有保护作用。炎症过程中，通常伴有促炎细胞因子的释放，TNF-α即是炎症过程中非常重要的促炎因子。本研究发现，BML-111能明显抑制LPS诱导的TNF-α表达。还有研究[20，21]发现，Nrf2还在肿瘤发生及肿瘤耐药方面发挥着关键作用，因此推测BML-111在抗肿瘤方面的作用也可能与Nrf2密切相关。

综上所述，BML-111预处理后，炎症状态的U937细胞中Nrf2蛋白核转位受抑制，Nrf2蛋白及其下游基因表达下调，TNF-α基因表达下调；BML-111可能是通过调节Nrf2蛋白及其下游基因表达、下调TNF-α表达从而发挥抗氧化应激作用。本研究结果为BML-111用于治疗败血症及炎症相关性肿瘤提供了新的实验依据。然而BML-111调控Nrf2的具体信号通路非常复杂，有待进一步深入研究，并需要在动物模型上进一步验证上述实验结果。