一个LIG4综合征家系基因突变分析和产前诊断

张鑫丽 沈国松 李雯雯 阳鑫妙

严重联合免疫缺陷病（severe combined immunodeficiency，SCID）是一组有不同基因异常所致的严重T细胞缺乏或功能异常，并伴随B淋巴细胞功能异常的疾病[1]。SCID是一类比较多见的原发性免疫缺陷病，新生儿的发病率为1/75 000～1/100 000[2]。目前发现的SCID相关基因有 13 个，包括 IL-2RG、ADA、JAK3、RAG1、RAG2、IL-TRa、DCLRE1C、LIG4、DNA-PKcs、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD45[3]。其中LIG4基因突变引起的SCID称为LIG4综合征，这是一种非常罕见的常染色体隐性遗传病，患儿常表现为发育异常和肿瘤倾向[4]。LIG4综合征是严重的致死性遗传病，药物治疗效果差，早期基因诊断行免疫重建是治疗和延长已出生患儿生存期的最好办法。但是，预防患儿出生是最终目标。因此，本研究通过应用芯片捕获后行高通量测序法检出先证者的基因突变，成功对其母亲再次妊娠进行产前诊断，有效避免患儿的出生；现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 先证者女，足月顺产出生，头围偏小，体重偏轻。1岁时因接种疫苗后开始持续有中耳炎、腹泻、巨细胞病毒感染，血常规检查提示全血细胞减少，对抗生素和免疫球蛋白的治疗效果差，一直转辗于本院与外院治疗。当时先证者及其父母均抽取外周血作基因检测。先证者3岁时因颅内肿瘤死亡。父母表型正常。现母亲再次怀孕（高龄并孕20周），为避免再次分娩LIG4综合征患儿，2016年11月8日来本院作产前诊断。

1.2 目标序列捕获 抽取先证者及其父母外周静脉血5ml，标准流程提取基因组DNA（QIAamp DNA Blood Midi Kit，德国Qiagen）。质检合格的基因组DNA使用Covaris LE220超声波仪（美国Massachusetts）进行随机打断，产生200～250bp的随机片段。随后进行Ampure Beads纯化，将纯化后的DNA片段进行末端修复、加“A”以及加接头反应，再经过连接介导PCR（ligationmediated PCR，LM-PCR）进行扩增和纯化。利用定制的1445号基因片段捕获芯片（Roche Nimble Gen，美国Madison）与20个标记好的患者DNA库47℃杂交64～72h，通过芯片杂交捕获下来的DNA片段用链霉亲和素磁珠富集，被捕获的片段使用LM-PCR生成测序用的DNA库。

1.3 序列分析 首先对生成的测序DNA库进行质检，去除低质量以及被接头污染的测序序列。合格的DNA库与Illumina测序原件上的互补接头进行杂交，然后使用高保真的DNA聚合酶对其进行扩增，在HiSeq 2000测序平台上进行高通量测序。测序深度＞100X，测序数据分析采用Illumina分析流程。使用Illumina basecalling 1.7软件进行原始图像数据处理。每条测序序列产生90bp的双向测序读长。

1.4 Sanger法验证 对所有发现的致病突变，在其所在片段上下游设计引物。行PCR扩增，对产物作Sanger测序，所得结果与LIG4基因标准序列进行比对，从而验证基因芯片捕获和高通量测序的结果。

1.5 羊水母血污染鉴定和产前诊断 对先证者母亲在超声引导下经腹行羊膜腔穿刺术抽取羊水20ml，其中10ml按标准流程提取基因组DNA后，选用16HS System试剂盒（Promega Corporation，美国Madison）、ABI3130XL遗传分析仪，与父母DNA进行个体识别和亲子鉴定。确定无母源污染后，再对羊水DNA的LIG4基因作针对性的Sanger法验证；另外10ml羊水用于常规细胞培养、制片及G显带核型分析。

2 结果

2.1 LIG4基因突变的确定 高通量测序显示先证者携带LIG4基因的复合杂合突变，位点为c.833G＞C（p.A278L），1271-1275del（p.K424fs），见图1。其中父亲携带c.833G＞C（p.A278L），是错义突变；母亲携带1271-1275del（p.K424fs），是框移突变。2个位点为已证实的突变，故本研究未在健康群体中验证。

图1 先证者LIG4基因测序图

2.2 胎儿的产前诊断 羊水DNA的LIG4基因经过Sanger验证，显示胎儿携带与先证者相同的LIG4基因突变位点，即 c.833G＞C（p.A278L），1271-1275del（p.K424fs）。胎儿的羊水染色体核型为46，XX。

2.3 遗传咨询 本院产前诊断中心告知该胎儿出生后将发展为LIG4综合征患者，家属选择终止妊娠。

3 讨论

LIG4综合征是一种DNA双链断裂后非同源末端链接（non-homologous end joining，NHEJ）通路缺陷病，为罕见的常染色体隐性遗传病，在2011版原发性免疫缺陷病分类中被归为联合免疫缺陷病[5]。其临床表现为辐射敏感，小头畸形，生长发育迟缓，联合免疫缺陷、自身免疫性疾病和肿瘤等。LIG4综合征的发病机制是LIG4基因异常。LIG4即DNA连接酶4，是NHEJ的核心组分之一，基因位于13q33-34。含有1个氨基端催化域和2个羧基端乳腺癌易感蛋白的LC末端结构域。LIG4和XRCC4通常以复合体的形式存在，主要参与DNA断链末端的对比和缺口填补，还能与DNA断链末端的DNA-Pkcs、Ku蛋白相互作用，促进DNA断链的连接。LIG4在复制和V（D）J重排过程中起着重要作用。因此，当LIG4缺陷时，若细胞出现损伤会因无法正常修复而死亡；或在发生免疫反应时，T、B淋巴细胞因受体重排障碍而失去免疫功能，从而导致联合免疫缺陷[6]。

Buck等[7]报道15例LIG4缺陷的患者中，有6例出现血液恶性肿瘤，2例为前T细胞白血病和（或）淋巴瘤，1例骨髓发育不良，4例出现B细胞增殖性疾病。而本例患儿的临床表现与上述报道相符，其LIG4的基因测序显示为1271-1275del（p.K424fs）的复合杂合突变。其中c.833G＞C（p.Arg278Leu）导致LIG4蛋白氨基酸（aa）序列第278位点发生密码子改变：由精氨酸变为亮氨酸；该aa位点位于活化中心周围的一个高度保守基因序列，其改变将导致LIG4功能明显受损[7]。已有该位点致病性的相关报道，Jiang等[8]同时用Sift和Polyphen软件对其蛋白功能进行预测，也认为对LIG4蛋白功能有害，该位点人群发生率极低。而1271-1275del（p.K424fs）的框移突变是已知的致病突变，它能使编码蛋白序列提前终止，产生截短蛋白或被降解，早期终止密码子启动无义突变介导的mRNA降解，大大降低mRNA表达及LIG4蛋白表达，该位点人群发生率也极低。由于LIG4综合征是一种常染色体隐性遗传病，患儿的父母为1个突变位点的携带者，未见发病；患儿为同一基因的复合杂合突变，对LIG4蛋白功能的影响大，使得患儿发病。LIG4综合征的患儿发病早、病情较重、早期致死，因此早期诊断并行造血干细胞移植是目前最有效的治疗手段。国外已报道1例LIG4基因复合杂合突变（q1+H282L+R581fs）的患者免疫重建成功[9]。但是，移植成功率低、移植后并发症多、医疗费用昂贵等限制了其临床应用。因此，避免患儿出生是产前诊断的根本目标。该家族父母再次生育LIG4综合征患儿的概率为1/4，且胎儿期患儿无典型的外观异常，无法用影像学检查来诊断，只能依靠基因测序。因此，本中心在患儿母亲再次妊娠时，根据孕妇年龄、孕周行羊膜腔穿刺术抽取胎儿羊水细胞，一部分进行胎儿核型分析；同时排除母源污染后用Singer法检测胎儿的LIG4基因，验证胎儿携带与先证者相同的致病突变，告知家属其出生后将发展成LIG4综合征患者，家属最终选择终止妊娠。此外，本中心已指导该夫妻想要生育健康的胎儿，可行三代试管婴儿，即胚胎植入前产前诊断，防止该遗传病的传递。

综上所述，本研究采用目标序列芯片捕获SCID发病相关基因，再通过高通量测序进行LIG4基因突变检测。芯片捕获高通量测序技术是新一代的测序技术，相较于传统单基因病成本高、适用疾病少、普及面低、通量低的检测方法，它能在较短时间内同时对几十万甚至几百万条DNA分子进行序列分析，因此更适用于对单基因病隐性遗传病携带者的筛查与产前诊断[10]。本次研究完成了1个LIG4综合征家系的基因突变鉴定和再次妊娠的产前诊断，避免了高危胎儿的出生。