纳豆粉与红曲粉组合对高脂小鼠的降脂效果

王素贞,黄占旺,黄永平,陈佳妮

(江西农业大学食品科学与工程学院,江西省天然产物与功能食品重点实验室,江西南昌 330045)

高脂血症是由各种原因导致机体内脂肪代谢的不平衡甚至是紊乱造成的,与心血管疾病、糖尿病、动脉粥样硬化和肥胖等密切相关[1-2]。目前国内外用于治疗高脂血症的药物主要有他汀类[3]、贝特类[4]、烟酸[5]和胆汁酸多价螯合剂[6],已被证明具有确切的降脂作用。然而,因为长期使用这类药物造成的肝肾毒性[7]、横纹肌溶解[8]和高血糖[9]等副作用,有些患者对其不耐受,所以近年来预防和治疗血脂异常具有辅助降血脂作用的保健食品得到了明显的关注。

纳豆冻干粉中含有纳豆激酶、异黄酮、超氧化物歧化酶、维生素等活性物质,具有抗氧化、溶血栓、抗肿瘤等生物功能。研究[10-12]发现纳豆冻干粉能够降低胆固醇和甘油三酯水平,可用于预防与治疗心血管疾病。红曲粉中有效的降脂活性成分为莫奈可林K,其能够抑制TC的合成,降低TC水平和提高HDL-C水平[13-14]。充分发掘两者组合配方的降脂效果,对于开发功能性保健食品具有重要的现实意义,但各组合配制浓度对小鼠的降脂活性作用尚未见报道。因此,本文以高脂肪饮食诱导的高脂小鼠为模型,探讨纳豆冻干粉和红曲粉组合对小鼠的降脂效果,有助于开发调节高脂血症的健康食品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纳豆冻干粉 2×1011CFU/g,实验室自制;红曲粉 福建购买的红曲米经高速粉碎机粉碎;KM小鼠 清洁级,雌性,25～30 g,许可证号(SCXK(湘)2016-0002),湖南斯莱克景达实验动物有限公司;灭菌动物饲料 许可证号(SCXK(湘)2014-0002),湖南斯莱克景达实验动物有限公司;精制猪油 河南众品食业股份有限公司;胆固醇、脱氧胆酸钠 北京索莱宝科技有限公司;甲基硫氧嘧啶 阿拉丁(上海)试剂公司;丙二醇、吐温-80 西陇化工股份有限公司;血清胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度蛋白-胆固醇(HDL-C)试剂盒 南京建成生物有限公司;蛋白质质量测定试剂盒 北京索莱宝科技有限公司。

AUY120型电子天平 日本SHIMADZU公司;TGL-20000-cR离心机 上海安亭科学仪器厂;Multiskan MK3酶标仪 美国Thermo electron公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪乳剂的制备 称取25.00 g猪油、10.00 g胆固醇、1.00 g甲基硫氧嘧啶于200 mL的烧杯中,加热搅拌混匀加入25.0 mL吐温-80,混匀后制成油相;另精确称取2.00 g脱氧胆酸钠于另一100 mL烧杯中,加入20.0 mL 1,2-丙二醇和60.0 mL蒸馏水,将其置于电炉上搅拌加热至完全溶解,此时制成另一相—水相。放冷至一定温度后将制备好的水相边搅拌边加入到油相中,充分搅拌均匀至乳白色,即得到脂肪乳剂,封口密闭放置-20 ℃冻存备用。

1.2.2 实验分组 将体重为25～30 g成年的KM小鼠统一在温度22～25 ℃、湿度40%～60%、光照比50%的环境下适应性饲养3d,按体重随机均衡分为8组,每组10只。动物体内实验分组和受试物的分配情况如表1。

表1 实验分组与受试物Table 1 The experimental groups and test sample

1.2.3 高脂模型建立与小鼠灌胃 除对照组外,其余小鼠组每天上午均灌胃给予0.2 mL/10 g的脂肪乳剂,按照上述表1每天下午对小鼠灌胃20 mL/kg BW的受试物或者溶剂(生理盐水),每天按此法持续灌胃30 d。

1.2.4 检测指标

1.2.4.1 形态观察与体重变化 观察灌胃期小鼠的精神状态、活动情况、体重、体毛、饮食等;每两天称重,记录小鼠实验期间体重变化并同时测定小鼠的摄食量。

1.2.4.2 器官指数 小鼠末次灌胃后禁食18 h,自由饮水,称重,乙醚处理后心室穿刺取血,4 ℃下2000 r/min离心15 min分离血清,分装冷冻保存备用。对小鼠进行解剖,肉眼观察小鼠体内脂肪沉积情况及脏器变化情况,取肝脏和体脂(肾和性腺周围脂肪垫组织),无菌生理盐水冲洗后吸干水分快速称重,计算肝体比、脂肪系数。其计算公式为:

体脂(g)=肾周围脂肪+性腺周围脂肪

肝体比(%)=肝脏重量/体重×100

脂肪系数(%)=脂肪总重/体重×100

1.2.4.3 血清各指数测定 将1.2.4.2保存的血清参照试剂盒说明书进行TC、TG、HDL-C含量的测定。计算动脉粥样硬化指数AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。

1.2.4.4 肝脏中TC、TG含量的测定 用0.9%生理盐水将肝脏制备成组织匀浆,参照试剂盒说明书测定其小鼠肝脏TC、TG水平。

1.3 统计学分析

采用DPS数据分析软件进行方差分析,统计计算结果以均值±标准差表示,并用Duncan’s新复极差法进行均值多重比较。

2 结果与分析

2.1 日常活动状况

实验期间,各组小鼠精神状况良好,无腹泻、便血等异常疾病的发生,皮毛光洁、紧贴于体表,行动反应迅速敏捷;生长状态良好,除空白对照组外,其余各组的小鼠体型上要稍大些。

2.2 小鼠体重变化

由表2可见,与对照组相比,其余各组小鼠体重增长有显著性差异(p<0.05),说明高脂血症小鼠在体重增长上快于正常小鼠,因脂肪乳剂的营养高于其他物质;与高脂模型组相比,各药物剂量组小鼠的体重增长无显著性差异(p>0.05),说明各受试物对小鼠体重的增长无影响。

表2 受试物对小鼠体重的影响Table 2 Effects of test sample on weight of

2.3 对小鼠肝体比、体脂、脂肪系数的影响

肝体比反映各受试物对小鼠肝脏的损害程度,体脂与脂肪系数联合反映了高脂饮食和受试物对小鼠脂肪堆积程度的影响。由表3可知，从肝体比上看,各组均无显著性差异,但纳豆粉组、红曲粉组和复合物组1～4均稍低于高脂模型组,稍微缓解小鼠肝脏肿大程度。

表3 受试物对肝体比、体脂和脂肪系数的影响Table 3 Effects of test sample on liver coefficient,fat weight and coefficient of

在小鼠体脂重量相比下,各组的体脂均极显著高于对照组小鼠(p<0.01),表明脂肪乳剂能够增加小鼠的体内脂肪,造模成功;与高脂模型组相比,复合物组4显著性降低(p<0.05),表明高剂量的纳豆粉和红曲粉能够降低高脂小鼠的体内脂肪。

从脂肪系数上看,各组与对照组相比均具有极显著性(p<0.01),明显高于正常小鼠的脂肪系数;与模型组相比,红曲粉组和复合物组3均显著低于高脂模型小鼠的脂肪系数(p<0.05),复合物组4极显著性低于高脂模型小鼠的脂肪系数(p<0.01);而与红曲粉组相比,复合物组4极显著性低于红曲粉组的脂肪系数(p<0.01)。

2.4 血清各指数水平

由表4可知，与对照组相比,高脂模型组小鼠的血清TC、HDL-C具有极显著性差异(p<0.01),血清TG具有显著性差异(p<0.05),TC和TG均有所增加,HDL-C则降低,表明脂肪乳剂能够调节小鼠血清的脂质水平,达到高脂状态,即造模成功。

表4 受试物对小鼠血清TC、TG、HDL-C和AI的影响Table 4 Effects of test sample on TC,TG,HDL-C,AI of mice

从TC水平上看,灌胃受试物后,红曲粉组、复合物组2、复合物组3、复合物组4均要极显著性地低于高脂模型组小鼠(p<0.01);与红曲粉组相比,复合物组4显著性地降低(p<0.05),表明不同浓度的纳豆粉和红曲粉在降低小鼠TC水平上发挥作用。

从TG水平上看,红曲粉组、复合物组2、复合物组4显著性地低于高脂模型组小鼠(p<0.05);而且与纳豆粉组相比,复合物组4的TG水平显著性降低(p<0.05);说明红曲粉、纳豆粉和红曲粉组合能够降低小鼠TG水平。

从HDL-C水平看,红曲粉组、复合物组2、复合物组4均要极显著性地高于高脂模型组小鼠(p<0.01);与纳豆粉组相比,红曲粉组、复合物组2、复合物组4均极显著性升高(p<0.01);说明红曲粉对提高小鼠HDL-C水平有显著效果。

而且,高脂模型组小鼠的AI值与对照组相比具有极显著性(p<0.01),高出几倍,说明灌胃脂肪乳剂可以显著性地增加小鼠患动脉粥样硬化相关疾病的概率;纳豆粉组与复合物组1与高脂模型组小鼠相比,AI值无显著性差异,而其余各组小鼠的AI值均显著性降低,表明纳豆粉和红曲粉组合能够减少其疾病的发生概率。

2.5 对小鼠肝脏脂质的影响

由表5可知，高脂模型组小鼠肝脏的TC、TG水平均极显著高于对照组小鼠(p<0.01),显示出脂肪乳剂也能够使得小鼠的肝脏脂质水平发生变化,高脂模型造模成功;红曲粉组、复合物组2、复合物组4小鼠的TC水平均显著低于高脂模型组小鼠的水平(p<0.05);复合物组4的TG水平显著低于高脂模型组小鼠的水平(p<0.05)。这表明纳豆粉和红曲粉以适当比例的组合可以辅助降低小鼠肝脏TC、TG水平,发挥降脂作用。

表5 受试物对小鼠肝脏TC和TG的影响Table 5 Effects of test sample on TC and TG level of

3 讨论

高脂血症尤其是血清总胆固醇升高是引起心血管疾病的危险因素,全世界每年估计造成440万人的死亡[15]。高脂血症状态是建立在以前有相似实验研究模型之上的[16-18]。这些研究是在体重为25～30 g雌性昆明小鼠中进行的,并且给予高脂饮食一个月。在这些研究中,正常饮食小鼠平均血清总胆固醇水平为1～2 mmol/L,高脂小鼠血清总胆固醇水平为2～3 mmol/L。这与我们研究中高脂模型组小鼠血清胆固醇水平(2.557±0.169) mmol/L一致。

有相当数量的人口、动物研究报道了红曲米的降脂作用,而且几个世纪以来已经在我国被用作膳食补充剂和草药的红曲米作为治疗高脂血症的药物[19]。红曲米的成分包括莫纳可林(洛伐他汀)等被认为在高脂血症的治疗中发挥重要作用[20]。临床研究表明,红曲米有将血清LDL-C水平降低10%～33%的可能[21-22]。双盲随机对照实验显示,与安慰剂相比,红曲米或其提取物可降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平[23-24]。一项随机对照动物实验表明,红曲米可防止喂食高脂肪饮食的小鼠发生肥胖、高脂血症和脂肪肝[25]。因此,红曲米不仅具有治疗潜力,而且具有预防高脂血症和肥胖症的潜力。动物研究表明,红曲米提取物在实验模型中能够降低脂质过氧化水平。印度品种红曲米水提取物的使用降低了脂质过氧化水平,并增加依赖于高胆固醇饮食喂养链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病大鼠的还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶剂量的水平[26]。实验性动脉粥样硬化兔模型中,红曲米能够降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和血液丙二醛水平[27]。在使用红曲米的许多动物与人体实验研究显示,胆固醇和甘油三脂水平一致下降。

谢嵩等[28]研究了不同剂量的纳豆激酶冻干粉对高脂模型大鼠的降脂功能,测定了大鼠的血清TC、TG水平,发现各剂量的纳豆激酶冻干粉均能显著地降低TC、TG水平,其表明纳豆激酶具有降脂作用。袁淑云等[29]通过自由进食高脂饲料造成的高脂小鼠模型,探究纳豆激酶提取液对小鼠血清TC、HDL-C和AI的影响,结果表明纳豆激酶提取液具有预防与降脂作用。张莹等[30]通过测定家兔血清额TC、TG、LDL-C、HDL-C水平得到纳豆激酶对家兔的脂质异常具有显著的调节和改善作用。段智变等[31]发现纳豆提取物能够降低LDL-C含量而提高HDL-C的含量,使得血清中的血脂水平降低,达到治疗效果。各研究表明纳豆冻干粉具有降低小鼠、大鼠和家兔血清TC、TG水平的作用。

纳豆冻干粉中的异黄酮能够使LDL受体发生正向调节,使LDL受体增加,从而影响血液胆固醇水平[32-33]。纳豆冻干粉的有效成分纳豆激酶对降低血脂功能起主要作用。纳豆激酶参与脂质代谢的调节,通过其对涉及脂质代谢的某些蛋白质靶标的蛋白水解活性。由于酶是反应的生物催化剂,如果在反应中相关酶失活,任何代谢反应都会受到不同程度的影响。红曲粉的有效成分莫奈可林K抑制HMG-CoA还原酶,使其活性降低,对降低胆固醇水平具有有效作用[34]。因此,两者组合时在降低血脂功能上能够起到相互促进作用,相辅相成,从而达到更佳的作用效果。

与这些研究相一致,我们预计与高脂模型组相比,所有实验组的脂质水平都下降。但发现与红曲粉组相比,只有高剂量组显示出较低的脂质水平。这些数据结果表明,红曲粉、纳豆粉均具有降脂作用,而且高剂量的红曲粉和纳豆粉在降脂作用上具有协同作用,共同辅助降脂。

4 结论

通过脂肪乳剂灌胃小鼠,建立高脂小鼠模型。在高脂小鼠基础上对纳豆粉和红曲粉的降脂功能进行探究,获得适当比例的复合物对小鼠的降脂活性指标,从而为开发纳豆粉与红曲粉复合物保健品提供研究基础数据。本文结果表明纳豆粉和红曲粉组合在适当比例下比单独使用纳豆粉、红曲粉在降低小鼠脂质水平上具有更明显效果。其对小鼠的体重增量无影响;与高脂模型组相比,高剂量(200 mg/mL)纳豆粉和中剂量(100 mg/mL)红曲粉组合的体内脂肪显著地低于高脂模型组水平(p<0.05);与高脂模型组相比,纳豆粉与红曲粉组合能够降低高脂小鼠血清TC、TG 水平,提高HDL-C水平。纳豆粉与红曲粉组合可以辅助降低小鼠肝脏TC、TG水平,发挥降脂作用。综上结果可知,纳豆粉与红曲粉两者相辅相成、取长补短,以适当比例组合在降低小鼠血脂方面能够发挥更加显著效果,用于预防血脂异常、心血管疾病、动脉粥样硬化等疾病。