针—菌液电晕放电与辉光放电实现等离子体灭菌*

贺珍珍， 蒋林秀， 陈彦伶， 邓敏超， 蒋永荣， 李 华

(桂林电子科技大学 生命与环境科学学院，广西 桂林 541004)

0 引 言

常规的医疗器械消毒灭菌方法存在温度高、时间长、有残留、危害环境等缺陷[1，2]。因此，需要研究新的灭菌方法。等离子体消毒灭菌技术能克服传统灭菌方法的一些局限性和不足，提高消毒灭菌效果，其突出特点是作用快速、灭菌效率高、作用温度低和清洁无残留[3]。

1996年,美国的Laroussi M课题组[4]在世界上首次将大气压低温等离子体技术应用于灭菌消毒。韩国Ku Y B等人[5]研究发现空气等离子射流在水环境下会使pH值降低，较低pH溶液对某些微生物的灭活效率有了很大提高。加拿大Lerouge S等人[6]研究了等离子体灭菌器中不同气体组分对细菌芽孢的蚀刻和杀灭作用，发现蚀刻速率越高灭菌效率越高。法国Terrier O等人[7]利用氧气等离子体杀灭空气中病毒，发现在空气流速为0.9 m/s，停留时间为0.44 s时，副流感病毒、合胞病毒和流感病毒分别下降了6.5，3.8，4 个对数。国内，华中科技大学卢新培等人[8]利用高压脉冲电源通入氦气及1 %氧气混合气体产生大气压室温等离子体射流，分析发现该射流中产生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species,RNS)对HepG2肝癌细胞的生理作用和细胞凋亡有很大影响。浙江大学郑超等人[9]采用沿水面的火花放电杀灭水中的大肠杆菌，当细菌密度低于106 cfu/mL时，仅数秒即可杀灭水中所有的细胞。

本文在大量实验的基础上，经过深入分析，研制了一种针—菌液等离子体装置，克服了目前大多等离子体产生设备体积庞大、功率消耗高等缺点，只需在正常大气压条件下、不需要外接惰性气体即可实现灭菌。设备体积小、易携带、效能好，可广泛应用于杀菌消毒的多种场合。

1 实验装置

图1为设计的实验装置，由0～-20 000 V可调的直流负高压电源、针—菌液放电装置、放电回路、测试系统等组成。针—菌液放电装置由1 mm的钨针和菌液构成，针接负高压，菌液接地。放电回路由直流负高压电源、12 MΩ镇流电阻器和1 kΩ测试电阻器构成，前者用于保护整个电路及实验的安全并且抑制放电过程中的电弧放电，后者用于使示波器读取的放电电流信号转换为电压信号，便于观察波形[10，11]。测试系统由示波器和万用表组成，万用表通过测量测试电阻器两端电压，获取电路电流，通过观察示波器波形判断电晕放电或辉光放电。

图1 整体实验装置

2 实验结果与分析

在镇流电阻值为12 MΩ，测试电阻值为1 kΩ，大气压环境、室温、无外部通入气流时进行等离子体灭菌实验。在针和菌液两端加电压，当施加的电压为-5 kV时，电流为几十微安(μA)，示波器出现如图2(a)所示的波形(特里切尔脉冲波)，即形成电晕放电。随着电压的增加，特里切尔脉冲波的频率增加，如图2(b)、图2(c)。当电压增加到-9.6 kV时，电流为几百微安，此时放电脉冲消失，波形为直流电压信号，如图2(d)，即进入辉光放电阶段，该放电波形演变为典型的电晕放电过渡到辉光放电的过程[12]。

图2 电晕放电到辉光放电过程的放电波形

采用尼康D7000及Sigma 150 mm f/2.8 EX DG HSM微距镜头对针—菌液的放电图像进行拍摄。当所加电压为-5 kV时，形成了电晕放电，此时放电主要集中在针尖处，针尖处出现了紫色的光芒，说明针尖处的场强最高。随着电压加大，发光的区域由针尖逐渐扩展到了菌液以及针与菌液之间的区域，当电压加到-9.6 kV时，形成辉光放电，有紫色的亮光，形状类似圆锥形，圆锥的顶部位于针尖附近，圆锥的底部位于菌液上[13]。

实验时,将菌液稀释104倍,并取100 μL置于培养皿与高压电源的地相连，采用直接灭菌方式对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)进行60 s灭菌。灭菌后再将该100 μL菌液涂抹于培养基并置于37 ℃的生化培养箱培养24 h。实验中设置了一组未经过等离子体处理的对照组以比较不同的灭菌效果，且为每个实验培养了两个培养皿样品以获得更为准确的实验结果。实验结果如图3所示，培养皿内衬底为培养基，斑点为菌落。

图3 针—菌液放电对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果

由图3可以看出：当处理时间相同，辉光放电产生的等离子体的杀灭效果优于电晕放电。可能与放电电压有关，放电电压增高过程中，灭活效果增加[14]。从实验可以看出：等离子体对细菌有高效的杀灭效果，这可能是因为空气中大气压放电会产生化学活性物质：氧离子和其他带电物质如N+,NO+,NO-，羟基和氢过氧基(OH和HO2)，氢过氧化物(H2O2)，一氧化二氮(N2O)和其他氮氧化物(NO,NO2,N2O4,N2O5)和中性物质，包括原子氧，臭氧和氧气单态的分子[15，16]。且有研究指出活性粒子(如 O，OH，NO2)在灭菌中起了最主要的作用[17]。当处理物中含有水分子时，等离子体即产生一定量的OH。OH具有较高的活性，与生物体作用时也可能起到重要作用。此外，OH容易溶解于水还会改变容液的pH值，从而起到间接作用[18]。

实验中，金黄色葡萄球菌经60 s电晕放电处理后杀灭率并未达到100 %。这可能与其细胞结构有关[19～21]，因大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，而金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌的细胞壁比较厚，而革兰氏阴性菌的细胞壁有两层膜，脂质成分比较高，使得等离子体中的各种活性物质更容易与其发生反应，且更容易在细胞外膜表面的积累带电粒子，产生了超过细胞膜自身张力的静电力，使细胞破裂发生溶解。另一可能的原因是金黄色葡萄球菌等电点(pI)为2～3，低于大肠杆菌等电点(pI)4～5，前者带更多负电荷[22]，而实验中加的电压为负电压，所以,与大肠杆菌相比，金黄色葡萄球菌的细胞内环境更难被破坏，更难杀灭。但辉光放电对金黄色葡萄球菌杀灭效果更好。

3 结 论

通过设计等离子体灭菌装置及其实验研究探讨了对医疗器械进行灭菌消毒的方法。实验结果表明：等离子体灭菌效果好、速度快。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌对2个实验变量的敏感性有较大差异，且辉光放电灭菌效果好于电晕放电。后续可根据前述影响及实验数据优化实验装置，如设计多针式装置，改变针间及针与培养皿中培养基表面的距离等。