结直肠癌组织中CEACAM-1、NET-1的表达变化及其意义

郭飞，林杨，张鹏程，王玉佳，屈明，薛军

(河北北方学院附属第一医院，河北张家口075000)

最新流行病学调查显示，中国男、女结直肠癌发病率分别为16.9/10万和11.6/10万，死亡率分别为9.0/10万和6.1/10万，5年生存率仅为32%，远低于美国和欧洲水平(64%和41%)，未来我国结直肠癌的负担形势不容乐观[1,2]。目前，对于结直肠癌临床常用的肿瘤标志物如CEA、CA199等对于病变的早期诊断均有一定的局限性，且特异性不高。因而深入探寻结直肠癌发生、发展的分子机制和特异性强、准确性高的分子生物学标志物，对于结直肠癌的早期诊断、术后监测及基因的靶向治疗有着极其重要的价值。癌胚抗原相关细胞黏附分子-1(CEACAM-1)作为癌胚抗原家族重要成员之一，能调控细胞增殖、凋亡和分化，同时介导肿瘤细胞的黏附，还参与了血管淋巴管新生等病理生理过程，具有多种恶性生物学行为[3]。NET-1是新近研究的一种肿瘤致癌基因，与肿瘤细胞的增殖、迁移和浸润密切相关[4]。研究证实，二者在乳腺癌、子宫颈癌、胰腺癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤中均呈高表达状态[5～8]，而在结直肠癌中鲜有报道。本研究检测结直肠癌组织及相应的癌旁正常结直肠组织中CEACAM-1和NET-1的表达及与相关临床病理参数间的关系，为临床早期诊断、治疗和预后监测提供准确的分子生物学标志物，为结直肠肿瘤的三级预防提供科学依据和参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年1月～2016年12月在河北北方学院附属第一医院接受手术切除的原发性结直肠癌患者50例，手术中留取癌组织和癌旁正常结直肠组织。所有病例均为原发性肿瘤，其中男29例、女21例，年龄(54.7 ± 8.1)岁，结肠癌19例，直肠癌31例，TNM分期Ⅰ期4例、Ⅱ期7例、Ⅲ期27例、Ⅳ期12例，术前没有进行针对性治疗，术后标本均在1 h内获得，并存于液氮中。

1.2 CEACAM-1、NET-1检测方法 用10%甲醛溶液固定标本，然后用石蜡进行包埋、切片。应用苏木素-伊红经典染色，再行病理诊断。使用80℃烤箱对切片进行30分钟的烤片，然后使用乙醇进行脱水，使内源性过氧化物酶失活，枸橼酸缓冲液高压高温水化修复；PBS洗3次，加入一抗，温度控制4℃过夜；PBS洗3次，加入二抗。接下来显色过程应用DAB显色试剂在室温下进行，通过在镜下看到的显色情况掌握显示的时间，而后用苏木素进行轻度复染，并使用盐酸乙醇(1%)进行5分钟分化，流水持续5分钟冲洗，另用80%、85%、90%、95%、100%的梯度乙醇脱水，最后用松节油5分钟透明和树胶封片处理。阴性对照为PBS代替一抗。 在细胞质中发现棕黄色颗粒作为CEACAM-1以及NET-1的阳性表达，依据视野所有细胞中发现的着色细胞所占百分比和着色细胞的染色程度强弱进行评分。其中着色细胞百分比≤5%计0分，6%～25%计分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，> 75%计4分；着色细胞无染色计0分，染色程度弱计1分，染色程度中计2分，染色程度强计3分。两者相乘≥1视为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料以%表示，率的比较用χ2检验，相关分析采用Spearman相关分析法，设检验水准为α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌、癌旁组织中CEACAM-1和NET-1表达情况 在结直肠癌组织中CEACAM-1的阳性表达率为68%(34/50)，癌旁组织中CEACAM-1的阳性表达率为28%(14/50)，两者相比，P<0.05；在结直肠癌组织中NET-1表达的阳性表达率为64%(32/50)，癌旁组织中NET-1的阳性表达率24%(12/50),两者相比，P<0.05。

2.2 CEACAM-1、NET-1表达与结直肠癌患者临床病理参数间的关系 CEACAM-1和NET-1的阳性表达均与肿瘤的TNM分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝转移及血管浸润有关(P均<0.05)，而与肿瘤大小、分化程度无关(P均>0.05)，见表1。

2.3 结直肠癌组织中CEACAM-1和NET-1表达的相关性 在结直肠癌组织中CEACAM-1、NET-1的表达呈正相关(r=0.497，P<0.01)。

3 讨论

近年来CEACAM-1在肿瘤发生进展中的作用备受关注，CEACAM-1是一种跨膜糖蛋白，属于癌胚抗原家族及免疫超蛋白家族黏附分子之一，最初由Okegawa等[9]在研究木瓜蛋白酶质膜的不溶性成分的某些作用和功能时被发现。CEACAM-1基因定位于人类染色体的19q13.2区域，由9个外显子按特定序列排列而成，在11种剪切方式下，可以生成11个不同的亚型，根据胞内段的长短可分为CEACAM-1-L和CEACAM-1-S两个亚组[10]。CEACAM-1-L胞内段含有2个免疫受体酪氨酸抑制基因序列，通过其磷酸化参与细胞内信号转导，其作用是对下游的信号进行抑制，CEACAM-1-S内含结合钙调节蛋白、原肌球蛋白及肌动蛋白三种结构域，这使得它拥有了调节细胞骨架的特殊作用。CEACAM-1-L以一种顺式的同源二聚体存在于细胞表面，有研究发现，在不同活化状态下的该细胞二聚体是不相同的，这种不同可能是因为其参与的信号调节通路的不同所导致。另外，研究[11，12]发现还有一些CEACAM-1-L亚组可以形成特定的反式二聚体，聚集在细胞间，介导细胞间的黏附。此外，文献[13]报道CEACAM-l蛋白参与了多种复杂的生物学过程，如调节细胞的增殖、凋亡以及细胞的分化，并对胰岛素代谢、微血管微淋巴管的新生和免疫的调节等生理过程具有重要作用。

表1 结直肠癌组织中CEACAM-1、NET-1的表达与临床病理参数的关系(例)

NET-1基因是与肿瘤相关的基因，是四聚体超家族的成员之一。NET-1基因定位于1p34.1，其mRNA全长为1297bp，编码序列为128～853bp，内含241个氨基酸开放阅读框，具有TM4SF的典型结构特征[14]。NET-1基因几乎表达于所有的人类组织及相应肿瘤，通过跨膜结构区域的半胱氨酸残基介导信号向胞外转导，对于肿瘤预后不良的发生具有重要的调节作用，能够参与到疾病发生发展的各个环节，在不同层面调节肿瘤的发生发展[15]。研究[16]证实，NET-1能通过激活ERK通路，诱导p27蛋白磷酸化、泛素化及降解，从而导致细胞周期调控紊乱；同时通过多种细胞外信号经ERK活化的方式逐级传递至细胞核，促进细胞无限增殖和迁移。

本研究显示，在结直肠癌组织中CEACAM-1和NET-1的表达显著高于癌旁组织，且二者均与肿瘤的TNM 分期、浆膜浸润、淋巴结转移、肝转移以及血管浸润有关。吴涛等[17]应用免疫组织化学方法检测结直肠癌组织、腺瘤组织和正常结直肠组织中CEACAM1、VEGF的表达情况，并记录MVD值，证实结直肠癌组织中CEACAM-1的异常表达能促进VEGF表达上调，参与肿瘤微血管的生成及血管浸润转移。申宝鸣等[18]报道大肠癌患者的血清中CEACAM-1水平明显超过正常组，因此考虑CEACAM-1很可能是大肠癌早期诊断的一项重要指标。李挺等[19]研究报道NET-1在正常结肠黏膜、腺瘤和癌组织中阳性表达分别为7.4%、23.0%和90.0%，差异明显，且与肿瘤分化、TNM分期和淋巴结转移等病理特点密切相关，以上研究报道均与本研究结果一致。二者的相关性分析表明CEACAM-1和NET-1在结直肠癌的发生发展中呈正相关，表明二者具有协同作用，二者对肿瘤细胞的增殖、迁移和浸润具有一致性，且二者均能诱导肿瘤微血管的形成和脉管的浸润，因而对于结直肠癌的诊疗，倡导二者联合检测。

综上所述，CEACAM-1和NET表达的异常增高参与了结直肠癌的发生、进展过程，与结直肠癌的病理特征密切相关，二者均可作为评估结直肠癌的潜在生物学指标，深入探究二者的作用机制，有望为结直肠癌精确治疗提供重要的理论依据。