转染miR-143的骨肉瘤细胞MG-63增殖能力、周期分布观察

齐巍，李勇，琚绍静，孙娜，张瑞杰

(1唐山市第二医院，河北唐山063000；2华北理工大学)

骨肉瘤恶性程度高，预后极差，远处转移发生早，所以探索新的治疗方法迫在眉睫[1]。基因治疗成为目前研究的热点，其中寻求有效的治疗靶点是基因治疗的关键问题之一[2]。微小RNA(miRNA)是近年来新发现的一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA，其通过与靶基因的mRNA3′-UTR完全或不完全互补配对结合，导致miRNA靶目标降解或翻译抑制从而调控基因表达，影响细胞增殖、侵袭、转移和凋亡等生物学行为[3]。miRNA-143是miRNA家族重要成员之一，是一种抑癌基因，在多种恶性肿瘤中呈低表达[4,5]。有研究[6]表明Bcl-2是miR-143的预测靶位点，miR-143通过调节Bcl-2表达促进肿瘤细胞调亡、抑制细胞增殖。本研究观察了转染miR-143的骨肉瘤MG-63细胞增殖能力、细胞周期变化，并探讨其机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 人成骨肉瘤MG-63细胞系购于中国医学科学院天津血液研究所。MG-63细胞用含10% FBS、1% NEAA、1%双抗的RPMI-1640完全培养基培养，并置于37 ℃、5% CO2条件下培养，2～3 d后细胞铺满瓶底，细胞生长汇合至80%时可进行传代。FBS、RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司；慢病毒载体购于上海吉玛制药技术有限公司，miR-143序列为5′-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3′，阴性对照NC序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；TRIzol试剂、M-MLV逆转录试剂盒、SYBR PCR试剂盒均购于美国Invitrogen公司；MTT试剂盒购于美国Biomol公司；miR-143抗体和Bcl-2抗体购于英国Abcam公司。

1.2 细胞分组及miR-143转染 取处于对数生长期的MG-63细胞，制成单细胞悬液，接种于6孔板中，分为实验组、阴性对照组和空白组。实验组转染miR-143序列，阴性对照组转染阴性对照NC序列，空白对照组加入PBS。转染操作步骤参照慢病毒说明书进行，转染48 h后置于激光共聚焦显微镜下观察并计算转染效率，各组转染率均为90%以上。RT-PCR检测结果显示，实验组、阴性对照组、空白组miR-143相对表达量分别为2.95±0.26、1.27±0.05、1.03±0.63，实验组miR-143相对表达量显著高于阴性对照组和空白组(P均<0.05)，说明本实验转染成功。

1.3 细胞增殖能力检测 转染24 h后收集各组细胞，以1.5×105/孔接种于96孔板中，每组设6个复孔。分别于12、24、48、72 h后加入15 μL的MTT(5 g/L)培养4 h，再加150 μL的DMSO，振荡10 min，用酶标仪测量570 nm波长处的吸光度值(OD值)，以此表示细胞增殖能力。

1.4 细胞周期分析 转染后继续培养12～24 h，收集各组对数期细胞，离心管中加入预冷的70%乙醇2 mL悬浮细胞，置于4 ℃条件下固定细胞24 h；再次重悬细胞，离心5 min，去除上清液，加入PI染液600 μL；在室温条件下避光40 min以上，再次过滤细胞悬液，经流式细胞仪分析不同周期细胞比例。

1.5 各组细胞中Bcl-2 mRNA及蛋白检测

1.5.1 Bcl-2 mRNA检测 采用RT-PCR法。收集各组对数期细胞，按TRIzol说明书提取各组细胞总RNA，用分光光度计定量检测。用逆转录试剂盒将RNA合成为cDNA后，进行PCR扩增反应。Bcl-2基因上游引物序列为5′-GCATGACTTCTCCCGCCTGTACCGT-3′，下游引物序列为5′-ACCTTAGCTGGCGCCGTACTGTTCT-3′，扩增产物长度为320 bp；内参β-actin上游引物序列为5′-GATGCTGCGACTGGTCCA-3′，下游引物序列为5′- CTGCAGCAGCTATGAACCTC-3′，扩增产物长度为368 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性30 s、57 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s，40个循环后再72 ℃终末延伸5 min。对RT-PCR的结果采用相对定量的方法进行分析。

1.5.2 Bcl-2蛋白检测 采用Western blotting法。提取各组细胞总蛋白，测定蛋白浓度，与缓冲液按比例混匀，每泳道每组样品取35 μg，进行SDS-PAGE电泳，配制5%的浓缩胶和10%的分离胶，进行电转，设置250 mA、90 min将凝胶中蛋白转移至PVDF膜；滴加100 μL的一抗Bcl-2(1∶2 000)、一抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃过夜；TBST洗10 min、共3次；加相应二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1.5 h；TBST洗膜10 min、洗3次，进行显色，扫描仪扫描条带，Image J软件分析灰度值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 实验组转染后24、48、72 h细胞增殖能力低于空白组和阴性对照组(P均<0.05)。详见表1。

2.2 各组细胞周期变化 实验组G0/G1期细胞比例高于空白组和阴性对照组，S期、G2/M期细胞比例低于空白组和阴性对照组(P均<0.05)。详见表2。

表1 各组转染后不同时间的OD值比较

表2 各组不同周期细胞比例比较

2.3 各组细胞中Bcl-2 mRNA及蛋白表达比较 实验组、阴性对照组和空白组Bcl-2 mRNA相对表达量分别为0.62±0.25、1.06±0.45、1.10±2.05；Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.083±0.039、0.215±0.035、0.233±0.016。实验组Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达量均低于空白组和阴性对照组(P均<0.05)。

3 讨论

miRNA是近年来新发现的一类非编码小分子RNA，长度约22个核苷酸。人类大约30%的基因表达受miRNA的调节。miRNA参与调控细胞周期、细胞分化、细胞增殖和凋亡等多种生物学过程[7]。miR-143是近年国内外研究较多的一种miRNA，其在肿瘤发生中具有一定的调节作用。miR-143在多种肿瘤中呈低表达，如骨肉瘤[4]、乳腺癌[8]、结直肠癌[9]、前列腺癌[10]、膀胱癌[11]、宫颈癌[12]等；其通过与KRAS、c-Myc、ERK5和Bcl-2等多个靶基因作用，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，促进细胞凋亡，增加抗肿瘤药物的敏感性。

研究[13]表明miR-143在骨肉瘤中呈低表达，且miR-143可抑制骨肉瘤细胞增殖和肿瘤形成，抑制细胞迁移和侵袭。我们前期研究表明，miR-143过表达可抑制成骨肉瘤143B细胞的侵袭及迁移能力[14]。本研究旨在观察miR-143过表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖和细胞周期的影响。我们首先通过慢病毒介导miR-143过表达转染骨肉瘤MG-63细胞，根据转染荧光判断转染率达90%，依据RT-PCR检测结果，实验组miR-143 mRNA相对表达量显著增高，说明慢病毒介导转染方法成功将miR-143转染入MG-63细胞。进一步观察发现，随着细胞培养时间延长，实验组细胞增殖能力逐渐降低，说明miR-143过表达能够抑制MG-63细胞的增殖；实验组处于G0/G1期的细胞比例显著增高，而处于S期和G2/M期的细胞比例显著降低，说明miR-143过表达能够延缓细胞周期进展。

Osaki等[15]发现通过微静脉注射miR-143可抑制裸鼠骨肉瘤细胞向肺部转移。Bcl-2属于抗调亡蛋白家族，Bcl-2的过表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。Bcl-2的过表达可使肿瘤细胞对放化疗的敏感性降低。Lee等[16]发现肾癌组织中Bcl-2的表达水平显著增高。Uchida等[17]的研究结果显示，使用Bcl-2反义核甘酸序列抑制Bcl-2表达后可抑制肾癌细胞的增殖并诱导其调亡，推测Bcl-2的反义序列可以用于肾癌的治疗。目前已发现多种miRNA可通过调节Bcl-2的表达而起到抑制肿瘤细胞增殖、诱导调亡的作用。Chen等[18]研究发现miR-181a可通过对Bcl-2的靶向调节作用而增加恶性胶质瘤对放疗的敏感性。还有学者发现，miR-143可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，促进细胞凋亡，而anti-miR-143促进宫颈癌HeLa细胞增殖，抑制细胞凋亡；高表达的miR-143可抑制Bcl-2蛋白的表达，而anti-miR-143可上调Bcl-2蛋白的表达量，miR-143通过靶向调节Bcl-2表达从而抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、促进细胞凋亡[6]。Zhang等[19]研究发现miR-143在骨肉瘤细胞中呈低表达，上调miR-143表达可以抑制细胞增殖活性及肿瘤形成能力并诱导细胞调亡，进一步证实Bcl-2可能是miR-143作用的靶基因。本研究结果显示，实验组Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达量均低于空白组和阴性对照组，提示miR-143可能通过作用于Bcl-2靶基因进而抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖、干扰细胞周期。

随着miRNA相关研究的不断深入，miRNA有望成为骨肉瘤靶向治疗的靶点。在骨肉瘤治疗中通过外源性上调抑癌性miRNA水平将成为基本研究方向。由于miR-143可抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡，具备开发成为抗肿瘤药物的潜在价值。通过外源性介导补充、上调抑癌性miRNA的水平将成为miRNA用于肿瘤治疗的基本方案。本研究结果也为我们进一步研究miRNA对骨肿瘤的调节作用提供了一定的理论依据。但目前对骨肉瘤与miRNA之间的作用机制还没有完全了解，对于外源性miRNA进入体内的途径、时效性、生物安全性和治疗效果等问题仍需深入探索。