氧化苦参碱对miR-122低表达、感染HBV肝细胞的抗病毒作用观察

张轩，王淏

(1广东省中医院/广州中医药大学第二附属医院，广州510120；2广州市血液中心)

乙型肝炎病毒(HBV)能够侵袭肝脏，并引起急性和慢性乙型肝炎。乙型肝炎的防治是一个全球性公共卫生问题，已引起世界各国的关注[1]。目前，乙型肝炎多采用核苷(酸)类似物和干扰素等抗病毒药物进行治疗，但干扰素不良反应较多，而核苷(酸)类似物长期使用容易使病毒产生耐药[2]。苦参碱类生物碱是从山豆根、苦参、苦豆子类中草药中提取分离出来的单体化合物，主要包括氧化苦参碱(OMT)、苦参碱等。现代药理学研究发现，以OMT为代表的苦参碱类生物碱具有保肝降酶、免疫调节、抗HBV及抗纤维化的作用[3]。OMT的抗病毒作用机制不同于核苷类药物，对临床上出现的拉米夫定耐药HBV具有显著的抑制作用[4]。但OMT的抗HBV作用机制尚未完全明确。有研究[5]表明，OMT可能通过提高细胞中微小RNA-122(miR-122)的表达水平来抑制病毒复制和抗原表达。因此，本研究观察了OMT对miR-122低表达、感染HBV肝细胞的抗HBV作用，从miR-122的角度进一步研究OMT的抗HBV作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要实验材料 HepG2.2.15细胞购自ATCC，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基(含100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素)中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，用Trypsin-EDTA消化液消化传代。DMEM培养基、磷酸盐缓冲液PBS、胰酶Trypsin-EDTA、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 μg/mL)、胎牛血清均购于GIBCO公司。OMT(纯度>98%)购于陕西昂盛生物科技有限公司。CCK-8试剂盒购于天根生物科技有限公司。miRNA荧光定量PCR试剂盒、miR-122抑制剂 hsa-miR-122-5p inhibitor、miR-122抑制剂阴性对照 inhibitor Negative Control #22购自广州市锐博生物科技有限公司。RNA酶抑制剂购自美国Thermo Scientific公司。荧光定量PCR试剂盒购自美国Bio-Rad公司。转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。

1.2 细胞分组与miR-122表达抑制方法 取1瓶处于对数生长期的HepG2.2.15细胞，制备2×104/mL的细胞悬液，按1 mL/孔接种于两个12孔细胞培养板。将细胞分为A、B、C、D、E、F组共6个组，每组设置3个复孔。细胞接种24 h后将A、B、C组更换为无血清DMEM培养基，D、E、F组更换为配制好的含4 mg/mL OMT的无血清DMEM培养基。同时A、D组加入转染试剂；B、E组加入转染试剂和miR-122抑制剂hsa-miR-122-5p inhibitor；C、F组加入转染试剂和miR-122抑制剂阴性对照inhibitor Negative Control #22。48 h后收集各组细胞，采用荧光定量PCR法检测miR-122。miR-122表达抑制率=(对照孔-实验孔)/对照孔×100%。

1.3 各组培养液上清中HBsAg、HBeAg及细胞中HBV DNA检测 于转染后48 h收集各组培养液上清和细胞，采用电化学发光法检测培养液上清中的HBsAg和HBeAg，采用荧光定量PCR法检测细胞中的HBV DNA。

2 结果

2.1 各组miR-122表达比较 A、B、C、D、E、F组miR-122相对表达量分别为1.00±0.26、0.72±0.15、1.04±0.28、3.09±0.94、1.27±0.59、3.00±0.62。B组miR-122相对表达量小于A、C组(P均<0.05)，miR-122表达抑制率约30%。E组miR-122相对表达量小于D、F组(P均<0.05)，miR-122表达抑制率约58%。

2.2 各组培养液上清中HBsAg、HBeAg水平及细胞中HBV DNA表达比较 E组培养液上清中HBsAg、HBeAg水平及细胞中HBV DNA表达低于B组，高于D组和F组(P均<0.05)。D组培养液上清中HBsAg、HBeAg水平及细胞中HBV DNA表达低于A组(P均<0.05)，F组培养液上清中HBsAg、HBeAg水平及细胞中HBV DNA表达低于C组(P均<0.05)。详见表1。

表1 各组HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平比较

3 讨论

miRNA在细胞增殖、凋亡、分化及个体发育等一系列生理过程中发挥着重要作用。miR-122作为肝脏特异性高表达的miRNA之一，在肝脏的分化发育和维持肝脏正常功能中发挥重要的作用，与肝脏的生物学功能及肝脏疾病发病密切相关[6]。miR-122能够促进丙型肝炎病毒(HCV)感染和肝内复制[7]；抑制miR-122能够减缓脂肪酸合成并能促进其氧化[8]；miR-122在肝癌组织中明显下调[9]。在HBV感染方面，miR-122能够抑制HBV的复制，可以作为新的乙型肝炎治疗靶点[10]。本课题组研究[5]发现，OMT能明显提高肝细胞中miR-122表达，同时对HBsAg、HBeAg和HBV DNA均具有明显的抑制作用。因此，我们推测OMT有可能通过提高miR-122的表达对HBV的复制产生抑制作用。本文在此基础上，进一步对miR-122在OMT抗病毒中的作用进行研究。我们先敲低miR-122的表达，结果显示B组miR-122相对表达量小于A、C组，E组miR-122相对表达量小于D、F组，表明HepG2.2.15细胞中miR-122表达敲低成功。进一步检测培养液上清中的HBsAg、HBeAg及细胞中的HBV DNA发现，D组低于A组(P均<0.05)，F组低于C组(P均<0.05)，提示OMT可抑制HBV的复制。E组培养液上清中HBsAg、HBeAg水平及细胞中HBV DNA表达高于D组和F组，表明miR-122敲低后，OMT对HBV复制的抑制作用减弱，推测OMT对HBV复制的抑制作用可能是通过调节miR-122表达实现的。

本文研究还发现，E组培养液上清中HBsAg、HBeAg水平及细胞中HBV DNA表达低于B组，说明即使miR-122表达抑制，OMT仍然可以降低HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平。推测其原因：①miR-122抑制剂并没有完全阻遏miR-122的表达，本研究中B组和E组miR-122的抑制率分别为30%和58%，OMT还可通过部分miR-122发挥作用；②OMT能够通过miR-122对HBV的复制起到抑制作用，但并不是惟一途径。OMT还有可能通过其他机制对病毒产生抑制作用。最近有研究[11]表明，OMT能够降低HBV感染小鼠模型的HBV DNA、HBsAg、HBeAg和HBcAg的水平，这种作用有可能与OMT促进CD4+T细胞产生干扰素γ有关。本研究中，OMT处理细胞72 h后，细胞形态趋于向正常肝细胞变化[5]，推测其可能通过某些机制改善肝细胞微环境，调节免疫细胞活性，从而达到抗病毒的作用，但具体机制有待进一步研究。

此外，本研究结果还显示，转染miR-122抑制剂48 h后，B组与A组HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平差异无统计学意义。也就是说，即使B组中miR-122的抑制率达到30%，也没有对病毒的复制产生影响，原因可能为HepG2.2.15细胞本身miR-122表达量较低，再对其进行抑制也不能使其表达量发生很大变化，因此不会对病毒的复制产生较大影响。

综上所述，OMT对miR-122表达下调HepG2.2.15细胞的抗HBV作用受到抑制，OMT可能通过调节miR-122的表达对HBV复制起抑制作用，但这可能只是OMT作用机制的一部分，OMT还可能通过其他途径对HBV复制产生影响。本研究结果为进一步研究OMT的抗HBV治疗机制提供了实验基础和理论依据。