CIK细胞对卵巢癌化疗耐药的逆转作用及对ERCC表达的影响*

王亚军，袁 越，柳海燕，张 琼，周 航△

(1.遵义医学院附属肿瘤医院腹部肿瘤科，贵州遵义 563000;2.黔西南布依族苗族自治州人民医院肿瘤科，贵州黔西南州 562400)

卵巢癌是恶性程度最高的妇科肿瘤，一般早期没有症状，确诊时有60%～70%的患者已属晚期，故卵巢癌5年的生存率仅为30%[1]。卵巢癌的主要治疗手段是肿瘤细胞减灭术和以铂类药物为基础的联合化疗，铂类药物抗瘤疗效确切，约80%的初治患者获得显著临床缓解，但仍有部分患者初次化疗不能控制病情，或者缓解后又发生肿瘤复发及转移情况但再次化疗效果欠佳，即出现多药耐药现象(multidrug resistance,MDR)，最终导致化疗失败[2-3]。因此探寻新的治疗手段以逆转化疗耐药是卵巢癌治疗研究的必然选择。

DNA损伤修复能力增强是导致卵巢癌顺铂耐药的主要原因之一，由铂-DNA加合物引起的DNA损伤修复主要通过核苷酸切除修复途径，而切除修复交叉互补基因组1(ERCC1)和切除修复交叉互补基因组2(ERCC2)是该途径的重要参与因子[4-8]。生物治疗是近年来肿瘤治疗中的重要进展之一，CIK细胞就是一种肿瘤过继免疫治疗方法。目前，国内外临床上以CIK细胞为主导的肿瘤免疫细胞治疗不断取得新的进展[9-10]，但有关CIK细胞是否能够抑制肿瘤细胞的DNA修复能力而逆转肿瘤化疗耐药的研究少见报道。本研究就CIK细胞对卵巢癌耐药细胞灵敏度的影响及其与ERCC1、ERCC2基因表达变化情况的关系进行研究，探索CIK细胞的治疗作用是否与部分逆转卵巢癌化疗耐药现象有关，为其治疗卵巢癌可能提供新的机制和理论补充。

1 材料与方法

1.1细胞培养 人卵巢上皮癌细胞耐顺铂株(SKOV3/DDP细胞)及敏感亲本细胞株(SKOV3细胞)均购自中国医学科学院肿瘤细胞库，其中SKOV3/DDP细胞株是以对顺铂敏感的SKOV3为亲本，使用顺铂连续作用并逐步提高药量而形成的耐药株。两组细胞均用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在37 ℃、5% CO2的孵箱内进行培养。CIK细胞是直接由本院细胞工程实验室(负责完成CIK细胞体外诱导及质量控制工作)提供。

1.2试剂与药品 RPMI-1640培养基、胎牛血清均购自美国Hyclon公司，MTT试剂购自美国Sigma公司，聚合酶链反应(PCR)引物、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)反应试剂盒均购自日本TaKaRa公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司，兔抗ERCC 1、兔抗ERCC 2 (XPD)购自美国Cell Signaling公司，兔抗β-actin购自博士德生物工程有限公司，山羊抗兔辣根酶标记购自北京中衫公司，PVDF膜购于美国Millipore公司，顺铂(DDP)购自德州德药制药有限公司。

1.3MTT法检测CIK细胞作用靶细胞前、后对DDP化疗敏感性的变化

1.3.1将对数生长期的SKOV3、SKOV3/DDP细胞制成5×104/mL的细胞悬液接种于无菌96孔培养板中，每孔100 μL。24 h后将不同浓度DDP(DDP药物终浓度分别为48.00、24.00、12.00、6.00、3.00、1.50、0.75 μg/mL)加入96孔板，每孔100 μL，每组设6个复孔。同时设置阴性对照组(不加顺铂)和调零组，放置在37 ℃、5% CO2的孵育箱中培养24 h。MTT法测光密度(OD)值，计算两组细胞的抑制率。

1.3.2按上述方法加CIK细胞，将CIK细胞以不同效靶比(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1)加入 96 孔板，每孔100 μL，每组设6个复孔。同时设置阴性对照组(不加CIK细胞)和调零组。计算两组细胞的抑制率、IC10值(即非细胞毒性剂量)。

1.3.3按上述方法加入无毒剂量CIK细胞后，再加入DDP。实验组中的两组细胞均加入各自IC10对应效靶比的CIK细胞，每孔100 μL，每组6个复孔，同时设置阴性对照组(等体积RPMI-1640培养液)和调零组。待培养24 h后，磷酸盐缓冲液(PBS)反复清洗去掉CIK细胞，再加入不同浓度DDP(DDP浓度同1.3.1)，每孔100 μL，继续孵育24 h。计算两组细胞的抑制率及逆转倍数(RF)。

1.4real-time PCR检测ERCC1、ERCC2 mRNA的表达 real-Time PCR检测DDP、无毒剂量CIK及CIK细胞分别作用两组细胞24 h后ERCC1、ERCC2 mRNA的表达情况。将上述细胞扩大培养，TRIzol法分别提取总RNA，反转录合成cDNA，再进行 PCR 扩增(PCR 引物序列见表1)。PCR反应条件：预变性 95 ℃ 30 s，进行1个循环 ；PCR反应95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，进行40个循环)；55 ℃开始，每0.4 ℃采集1次荧光，每次10 s，共采集100次。在PCR扩增过程中设立无模板阴性对照。采用2-△△CT法进行相对定量分析，以β-actin为内参基因对上样量进行校正。每组设3个样本，重复3次。

表1 引物制备及引物序列

1.5Western-blot检测ERCC1、ERCC2蛋白的表达 Western-blot检测DDP、无毒剂量CIK及CIK细胞分别作用两组细胞24 h后ERCC1、ERCC2蛋白的表达情况。细胞裂解液冰浴细胞5 min提取总蛋白后，BCA法对总蛋白进行定量。总蛋白加十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液后，沸水浴3～5 min。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PVGE)，凝胶上的蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭40 min，分别加入兔抗人ERCC1单克隆抗体、兔抗人ERCC2单克隆抗体和兔抗人β-actin单克隆抗体(均1∶1 000稀释)一抗4 ℃轻摇过夜，洗脱，辣根过氧化酶标记二抗室温轻摇1 h，洗脱。PVDF膜采用增强化学发光显影X胶片，暗室曝光。使用Quantity one图像分析软件测定蛋白质条带的灰度值，以β-actin作为内参后计算其蛋白相对表达水平。重复3次。

2 结 果

2.1DDP、CIK细胞、CIK细胞联合DDP对SKOV3、SKOV3/DDP细胞增殖的影响 DDP对SKOV3、SKOV3/DDP细胞均有杀伤效应，且两组靶细胞的杀伤率均随DDP浓度的增加而增强(表2)，DDP对SKOV3、SKOV3/DDP细胞的IC50值分别为(2.47±0.01)、(6.96±0.03)μg/mL，相同浓度作用下，DDP对SKOV3的杀伤活性高于SKOV3/DDP，差异有统计学意义(P<0.05)。CIK细胞对SKOV3、SKOV3/DDP细胞均有杀伤效应，且杀伤活性随效靶比的增高而增强(表3)，CIK细胞对SKOV3、SKOV3/DDP细胞的IC10效靶比(即无毒剂量效靶比)分别为16.92∶1和14.09∶1，相同效靶比作用下，CIK细胞对SKOV3/DDP的杀伤活性高于SKOV3，差异有统计学意义(P<0.05)。加用CIK细胞共培养后，发现DDP对SKOV3和SKOV3/DDP的体外杀伤活性显著增强(表4)，无毒剂量CIK细胞联合DDP作用后，SKOV3/DDP细胞的IC50降低为(4.90±0.02)μg/mL，RF=1.42，即与单纯DDP作用相比，CIK细胞联合DDP对SKOV3/DDP具有较明显的协同作用，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2CIK细胞干预SKOV3、SKOV3/DDP前后ERCC1和ERCC2 mRNA的表达情况 SKOV3和SKOV3/DDP细胞株中ERCC1 mRNA的相对表达量分别为0.78±0.03和0.98±0.13；ERCC2 mRNA的相对表达量分别为0.23±0.03和0.56±0.01，即SKOV3/DDP和SKOV3相比，ERCC1、ERCC2 mRNA表达量均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。当CIK细胞干预SKOV3和SKOV3/DDP细胞株后，ERCC1 mRNA的相对表达量分别为1.11±0.02和0.71±0.02；ERCC2 mRNA的相对表达量分别为0.39±0.08和0.45±0.06，即CIK细胞干预SKOV3/DDP细胞株后，与未干预组相比,ERCC1 mRNA 表达量显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)；ERCC2 mRNA表达水平下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、2。

表2 DDP作用SKOV3、SKOV3/DDP细胞24 h后的抑制率%)

*：P<0.05，与SKOV3细胞比较

表3 CIK细胞作用SKOV3细胞、SKOV3/DDP细胞24 h的抑制率%)

*：P<0.05，与SKOV3细胞比较

表4 无毒剂量CIK细胞联合顺铂作用SKOV3细胞、SKOV3/DDP细胞24 h的抑制率%)

*：P<0.05，与SKOV3细胞比较

2.3CIK细胞干预SKOV3、SKOV3/DDP前后ERCC1和ERCC2蛋白的表达情况 SKOV3和SKOV3/DDP细胞株中ERCC1蛋白的相对表达水平分别为0.39±0.01和0.59±0.00；ERCC2 蛋白的相对表达水平分别为0.69±0.00和0.59±0.00，即SKOV3/DDP和SKOV3相比，ERCC1、ERCC2 蛋白表达水平均增高，差异有统计学意义(P<0.05)。当CIK细胞干预SKOV3和SKOV3/DDP细胞株后，ERCC1蛋白的相对表达水平分别为0.39±0.08和0.45±0.06；ERCC2蛋白的相对表达水平分别为0.41±0.08和0.33±0.01。Western-blot提示CIK细胞干预SKOV3/DDP细胞后，ERCC1、ERCC2蛋白均表达下降，但ERCC1蛋白表达量下降差异有统计学意义(P<0.05)，而ERCC2蛋白表达水平下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、4。

*：P<0.05，与SKOV3/DDP+CIK比较；#：P<0.05，与SKOV3比较

图1各组细胞中ERCC1 mRNA的表达

*：P<0.05，与SKOV3/DDP+CIK比较；#：P<0.05，与SKOV3比较

图2各组细胞中ERCC2 mRNA的表达

1:SKOV3/DDP;2:SKOV3/DDP+CIK;3:SKOV3;4:SKOV3+CIK

图3各组细胞中ERCC1蛋白的表达

1:SKOV3/DDP;2:SKOV3/DDP+CIK;3:SKOV3;4:SKOV3+CIK

图4各组细胞中ERCC2蛋白的表达

3 讨 论

卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤,肿瘤细胞减灭术和以铂类药物为基础的联合化疗是治疗卵巢癌的主要手段，其中铂类药物抗瘤疗效确切，但长期应用所产生的耐药性，成为卵巢癌治疗难以获得显著效果的主要瓶颈。细胞免疫治疗是一种被认为有可能治愈癌症的方法，它通过打破机体对肿瘤细胞的免疫耐受，增强机体免疫系统对肿瘤的免疫反应[11-12]。关于细胞免疫治疗联合化疗协同治疗恶性肿瘤已有相关报道[13-14],但对MDR肿瘤的协同治疗报道较少,且尚未阐明这一互补性杀伤的机制。

本研究中采用了MTT法检测DDP对人卵巢癌细胞SKOV3及卵巢癌耐DDP细胞SKOV3/DDP两组细胞的体外杀伤效应。结果显示DDP对SKOV3及SKOV3/DDP的杀伤活性均随DDP浓度的增高而增强，但与SKOV3细胞相比，同浓度DDP对SKOV3/DDP细胞的体外杀伤活性更低，说明与亲代敏感细胞相比，DDP杀伤耐药卵巢癌细胞效应的能力显著下降。以往的研究已证明DDP是一种与细胞DNA结合，诱导细胞凋亡的铂类化合物，本研究结果亦证实卵巢癌敏感和耐药细胞凋亡是DDP发挥细胞毒效应的结果。本研究还显示CIK细胞对耐药细胞SKOV3/DDP的杀伤效应高于SKOV3，与文献[15]报道相符。石永进等[16]研究认为CIK细胞可能是导致化疗药物在MDR肿瘤细胞内积累量明显增加的主要原因之一，尤其是MCF7adr核膜上P-gp表达的降低，必将导致化疗药物更易于进入其作用靶点-细胞核，进而引起免疫效应细胞联合低于IC50剂量的化疗药物，对MDR肿瘤细胞的杀伤活性明显高于单纯用同等剂量化疗药物或单纯用相同效靶比的CIK细胞杀伤活性。本研究结果发现，CIK细胞联合DDP对两种靶细胞的杀伤活性均随DDP浓度的升高而增加，且较单纯使用DDP或CIK细胞的杀伤活性明显增加，且在低效靶比CIK细胞联合化疗药物作用于SKOV3/DDP细胞的情况下，仍可大幅度提高耐药细胞对化疗药物的灵敏度，提示CIK细胞存在部分逆转化疗药物耐药的作用。因此，CIK细胞联合DDP治疗耐药性卵巢癌患者有可能会成为发展前景良好的综合治疗方案，值得进一步研究探讨。

DNA损伤修复能力增强是铂耐药的主要原因，核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)是DNA修复机制中的一条重要途径[4]。ERCC1是NER途径的限速酶，有研究显示ERCC1基因的高表达与DDP在多种肿瘤中的耐药性相关，还可作为判断肿瘤患者铂类药物化疗灵敏度的指标[16-17]；封闭或下调ERCC1基因可逆转卵巢癌细胞铂耐药[18]。ERCC2是NER通路中一种重要DNA修复基因，它能使受损的DNA被特异性核酸内切酶切除，进而使受损DNA得以修复[19-20]。肺癌中ERCC2各基因型与铂类化疗缓解率相关性的研究结果报道不一，甚至有研究报道称，ERCC2的单核苷酸多态性(SNP)与化疗灵敏度无关[21]，然而ERCC2基因在卵巢癌组织中的表达与药物化疗疗效、耐药之间关系的报道尚无定论。本次实验利用Real-time PCR及Western blot检测SKOV3、SKOV3/DDP细胞经无毒剂量的CIK细胞干预前后ERCC1、ERCC2 mRNA及蛋白的表达情况，结果提示CIK细胞逆转卵巢癌细胞的耐药性可能与ERCC1 mRNA表达下调有关，同时佐证了ERCC1基因在肿瘤细胞耐药中的重要作用，为今后临床应用CIK细胞提高卵巢癌化疗药物灵敏度及改善患者的生存和预后提供更有力的实验证据。但肿瘤的发生、发展及转移是由多基因、多因素共同作用的结果，因此还需要深入研究与ERCC1共同作用的相关基因及其导致卵巢癌耐药的作用机制。本研究结果还显示，SKOV3/DDP细胞内ERCC2 mRNA及蛋白的表达均明显高于SKOV3细胞，说明ERCC2可能与SKOV3/DDP细胞对DDP耐药相关，但CIK细胞未能降低SKOV3/DDP中ERCC2的mRNA及蛋白表达，提示CIK细胞逆转SKOV3/DDP细胞对DDP的耐药作用可能与ERCC2无相关性。目前有关ERCC2基因与卵巢癌耐药疗效判断的相关数据十分有限，DDP的耐药性及逆转耐药作用与ERCC2关系还有待进一步扩大样本量研究，并与其他DNA修复基因进行联合分析。