孕驴尿中雌激素类物质的组成及活性

左晓佳，张蓉银，柴 婷，高维明

(新疆畜牧科学院 畜牧业质量标准研究所，乌鲁木齐 830000)

天然的雌激素类物质最早是从马尿中获得的多种天然结合态雌激素的混合物，可以用于制备雌激素替代疗法的药物，对人体多种因雌激素缺乏而引起的更年期综合疾病有较好疗效，早在20世纪40年代，美国惠氏-艾尔斯特制药公司生产的结合雌激素药物倍美力就已经正式上市使用[1-2]。而目前该类原料药的来源基本都是孕期马尿，其他动物孕期尿液的研究鲜见报道。

马属动物的消化器官构造和代谢机能基本相同，理论上尿液中也应包括雌激素代谢的所有中间产物，即雌激素结构类似物。据世界粮油组织(FDA)统计，截至2013年，全球马的存栏量5 977万头，驴4 353万头。中国养驴历史悠久，家驴的遗传多态性丰富[3]，据国家统计局公布的2017年统计年鉴，截至2016年，中国马的存栏量达到550.7万头，驴456.9万头，新疆地区马存栏量达到89万头，驴54.6万头。因此，驴尿将是获得天然雌激素类药物的又一强势来源，同时也将为农牧民带来极大的经济效益。鉴于此，本研究通过采集怀孕6个月孕驴的尿液，提取雌激素类似物，通过动物试验检测其活性，为孕驴尿的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

孕驴尿采自怀孕6个月的新疆驴(新疆沙湾县隆源养殖合作社提供)；试验小鼠为50只SPF级昆明小鼠(新疆医科大学医学试验动物中心提供)，雌性，18～19日龄，个体质量12～16 g，以阴门未开作为未性成熟标志。按小鼠个体质量随机分为5组，饲养在SPF级动物房，保持12 h照明/12 h黑暗的光照周期，温度(23±1)℃，湿度(60±10)%，自由饮水进食。

雌激素标准品：雌酮硫酸钠标准品、马烯雌酮标准品、17α-马烯雌酮标准品(美国USP公司)、雌二醇、雌三醇(中国食品药品检定研究院)；DH100大孔吸附树脂(郑州勤实科技有限公司)；阳性药物：红利来结合雌激素片(新疆新姿源生物制药有限责任公司，国药准字H20090172)。

1.2 主要仪器

UPLC超高效液相色谱仪(Waters公司，美国)；RM 2126 组织切片机(Leica公司，德国)；LC-MS TQD三重四极杆液质联用仪(Waters公司，美国)。

1.3 方 法

1.3.1 雌激素类似物提取 采集到的孕驴尿低温避光静置6 h，10 000 r/min 离心后，经0.22 μm微孔滤膜过滤去除不溶物，得到清澈明亮的黄色液体。采用固液萃取方式分离获得雌激素类物质的混合物[4-5]，用DH100大孔树柱层析，流速6 mL/min，按填料体积∶上样体积=1∶10上样，乙醇洗脱。再使用UPLC超高效液相色谱C18柱分离样品[6-7]，流动相为V(乙腈)∶V(磷酸二氢钾)=30∶70溶液，流速0.4 mL/min。在紫外检测器215 nm下检测目标产物峰。收集产物峰经质谱定性[8-9]。

1.3.2 纯化产物活性检测 参照文献[10-11]的方法对小鼠进行处理。处理方式如下：试验小鼠分别用280、140、70 ng/g提取物进行灌胃，每天给药1次，以常规饲养为阴性对照组，阳性对照组用280 ng/g阳性药物处理。

阴道开口时间及开口率：从第2天开始观察阴道是否开口，记录时间和数量，以开口>2 mm作为开口标准，最后计算阴道开口率。

子宫质量及子宫系数：最后一次给药24 h后用乙醚麻醉处死，解剖后称量小鼠个体质量及子宫质量，计算公式为子宫系数=子宫质量/体质量×100%。

阴道上皮组织切片：解剖后每组随机选3只取阴道上皮组织(5 mm×5 mm×2 mm)，使用Bouin固定液(饱和苦味酸300 mL+甲醛100 mL+冰醋酸200 mL)固定5 h；用φ=50%酒精浸洗数次，之后逐级增加酒精体积分数(60%～100%)，各体积分数分别浸泡2 h至完全脱水；使用V(纯酒精)∶V(二甲苯)=1∶1和二甲苯溶液

分别浸泡30 min进行透明化处理；然后浸在溶解并保温55 ℃的石蜡内1 h，再将组织与石蜡一起包埋入包埋盒中，将组织待观察面平铺向下摆放好，并赶出气泡；冷水中冷却凝固后将蜡块固定在切片机的持腊器上，以厚度5～7 μm 进行切片；将较好的切片在40 ℃水浴中铺展，然后固定在载玻片上于烘箱45 ℃烤干；经HE染色(苏木精5 min，伊红2 min)，同样上述方法脱水和透明化处理，之后用树胶封固，加盖盖玻片，晾干后用显微镜观察阴道上皮细胞的角质化情况。

1.4 统计分析

试验数据用SPSS 22进行显著性分析和单因素方差分析，对差异显著的数据用LSD和S-N-K法进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 提取纯化试验中雌激素结构类似物的结构初步鉴定

避光静置6 h后，经0.22 μm避光微孔滤膜多次过滤，最后用透明橙黄色的液体作为纯化原料最好，超过则会引起雌激素类化合物的降解或析出。从图1可以看出，洗脱液在0.95 min有一个明显的特征峰与图2一致，对照混合标准品(包括雌酮硫酸钠、17α-马烯雌酮、马烯雌酮、雌二醇、雌三醇)液相谱图(图3)可以发现，该峰有可能是马烯雌酮峰。

图1 洗脱液超高效液相谱图Fig.1 UPLC spectrogram of eluent

图2 红利来结合雌激素药物液相谱图Fig.2 UPLC spectrogram of conjugated estrange drug Honglilai

鉴于此，分离该峰进行质谱分析，结果如图4所示，可以明显看出有一个质核比为267.31的物质响应强烈，对比马烯雌酮分子质量可以断定该物质为马烯雌酮的母离子，证实液相对比的分析结果，定量分析其质量浓度为500 μg/mL。

图3 混标液相谱图Fig.3 UPLC spectrogram of mixed standards

图4 马烯雌酮质谱图Fig.4 Mass spectrogram of equilin

2.2 纯化产物活性评价

2.2.1 阴道开口时间及开口率 由表1可知，阳性对照组和处理组都从第3天给药结束后，开始有阴道开口现象，之后逐天增加，而阴性对照组直到试验结束也未有阴道开口的小鼠出现。所有处理组小鼠无体质量明显减少或死亡等不良现象。

结果表明，在纯化的雌激素结构类似物作用下，小鼠呈明显提前发育状态，并且随质量分数增加，阴道开口的小鼠数量呈明显上升趋势。280 ng/g组的开口率略低于阳性对照组。

2.2.2 子宫质量及子宫系数 由表2可知，2 个指标分析结果一致，4个给药组与阴性对照组差异均极显著(P<0.01)，阳性对照组和70 ng/g组差异极显著(P<0.01)，与其他处理组差异不显著，280 ng/g组和140 ng/g组与70 ng/g组差异显著(P<0.05)。

2.2.3 阴道上皮细胞角质化程度 小鼠性成熟后，阴道上皮细胞发生角质化，并随着角质层的增厚出现脱落现象，因此，从小鼠阴道上皮细胞切片图能直观地看出阴道角质化程度。从图5可以看出，阴性对照组阴道上皮细胞完整，未见角质化，阳性对照组角质化明显，各处理组均有较明显的角质化，甚至140 ng/g组程度比280 ng/g组和阳性对照组强烈。

表1 各组小鼠阴道开口状态Table 1 Vaginal opening state of mice in each group

表2 子宫质量及子宫系数显著性分析Table 2 Significance analysis of uterine massand uterine coefficient

注：同列数据不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Different lowercase letters in the same columns indicate significant difference (P<0.05), and uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

3 讨 论

目前，治疗雌激素缺乏症所使用的药物主要是从孕马尿中提取的结合雌激素，是多种天然固醇类结合态雌激素的混合物[1-2]。早在20世纪30年代就围绕其开展多方面的研究。

中国驴种资源丰富，然而随着社会进步和运输业的快速发展，驴在中国大部分地方的役用地位明显降低，主要驴品种种质资源逐步退化，目前驴的饲养主要用于产皮、产肉、产奶，而尿液的利用研究鲜见报道。相较于马，驴饮水量小，食量小，但纤维消化能力强，不易得消化器官疾病，对蛋白质的吸收略低于反刍动物，而高于马、骡子。

图5 阴道上皮组织切片图Fig.5 Vaginal epithelial tissue slices

并且驴性成熟早，繁殖率比马高，驴体内雌激素的代谢率理论上比孕马高，从其尿液中应该能够提取出更多的雌激素结构类似物。

本研究发现，孕驴尿中的确含有雌激素结构类似物并分离出马烯雌酮，质量浓度约为500 μg/mL，同时发现有少量17α-马烯雌酮的脱氢化合物和雌二醇的脱水产物，具体结构并不能确定，但已基本证实孕驴尿中同样可以获得雌激素结构类似物的混合物。

本研究中随提取物的质量分数增加，阴道开口率明显呈上升趋势，然而280 ng/g组的药效比280 ng/g的阳性对照组略差，推测可能是由于提取物中除马烯雌酮外，其他雌激素类似物的组成比例不同，协同效应不同。同样可以解释阴道上皮细胞观察到的角质化结果，140 ng/g组角质化比阳性对照组更明显。子宫系数也证明140 ng/g和280 ng/g 组和阳性对照组均与阴性对照组差异极显著(P<0.01)，说明孕驴尿中获得的雌激素结构类似物同样具有令小鼠性成熟提前的效果，可以考虑作为替代药物来源。

试验还发现，提取物与阳性药物的药效差异较小，而且140 ng/g组和280 ng/g组药效差异不大，从成本考虑，孕驴尿中提取的雌激素类物质将成为更低廉高效的原料药物。然而从子宫质量数据中也可以看出，提取物的子宫质量低于阳性药物组，从另一方面说明提取物的纯度还有待提高，纯化方法还有待优化，混合物中除马烯雌酮外其他组分的结构还有待进一步确认。

4 结 论

发现孕驴尿中存在和孕马尿中相似的成分，尿液原样中含有马烯雌酮500 μg/mL，此外还检测到其他雌激素结构类似物，具体结构还有待证实。该提取物具使小鼠性成熟明显提高的药效。