丹蛭降糖胶囊对糖尿病动脉硬化模型大鼠胸主动脉p22phox mRNA、p47phox mRNA表达的影响

罗云，方朝晖

1.杭州市余杭区中医院，浙江 杭州 311106；2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

糖尿病患病率及患病人数急剧上升，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后第3大对人类健康构成严重危害的非传染性疾病。糖尿病大血管病变是糖尿病的主要并发症之一，主要累及心、脑、下肢等外周大血管，是糖尿病致死致残的主要原因。既往研究证实益气养阴活血方丹蛭降糖胶囊(DJC)可以降低血糖，调控血脂，改善胰岛素抵抗，调控炎症因子，防治糖尿病血管并发症[1～6]。本研究探讨DJC对糖尿病动脉硬化模型大鼠p22phox、p47phox mRNA表达的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠60只，清洁级，体质量(210.45±4.26)g，由安徽省实验动物中心提供[SCXK(皖)：2011-002]。动物饲养在安徽中医药大学第一附属医院实验中心动物房，室内温度控制在18～22℃，湿度40%～70%，分笼喂养，给予充足的饲料及饮用水。

1.2 药物和试剂 DJC(安徽中医药大学第一附属医院，批号：20131126)；链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)；0.1 mmol/L柠檬缓冲液(北京夏斯生物技术有限公司)；柠檬酸/柠檬酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；引物(invitrogen公司)；Na2-EDTA·2H2O(华绿渊生物公司)；dNTP(Promega 公司)；两步法qRT-PCR试剂盒(Thermo公司)；SOD、GSH-px、ET、一氧化氮(NO)检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.3 仪器 血糖仪、试纸(美国强生公司)；普通PCR仪(杭州晶格科学仪器有限公司)；电泳仪(Tanon EPS 300型)；全自动生化分析仪(日本日立公司)；高速台式冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；三洋-80℃低温冰柜(日本SANYO公司)；温度梯度基因扩散仪(德国MIONETRA)；紫外凝胶成像系统(北京科创锐新生物科技有限公司)；微量移液器、排枪(德国Eppendorf)；切片机(德国LEICA公司)；全自动封闭式组织脱水机、包埋机、组织漂烘仪(常州市中威医疗仪器有限公司)。

1.4 造模及分组 SD雄性大鼠60只，适应性喂养1周，随机分为空白对照组10只与造模组50只。空白对照组予普通饲料喂养。造模组按70万IU/kg的总剂量灌胃维生素D3，分3天给完，同时高脂饲料喂养，诱发快速动脉硬化的大鼠模型[7]。4周以后，采用35 mg/kg STZ腹腔注射，诱发糖尿病合并动脉硬化大鼠模型。注药72 h以后，所有大鼠禁食不禁水12 h测量血糖，同时，随机选取空白组大鼠1只和模型组大鼠2只并处死，取胸主动脉2～3 cm，用于观察主动脉粥样硬化病变及其程度，将出现主动脉硬化病变及血糖≥16.7 mmol/L确定为造模成功[8]。模型大鼠继续给予高脂饲料喂养一直到实验结束为止。最终造模成功的大鼠总共有39只，将这些大鼠按照随机化原则分为4组，分别为模型组，丹蛭降糖胶囊(DJC)低、中、高剂量组，大鼠数量分别为9、10、10、10只。

1.5 给药方法 按单位体质量剂量来算，大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍[8]。将等效剂量定为DJC中剂量，DJC中剂量的1/2、2倍分别为DJC低剂量和高剂量，计算出DJC低、中、高剂量分别为0.235、0.470、0.940 g/(kg·d)。空白对照组和模型组予生理盐水5 mL/(kg·d)灌胃，灌胃时间均为12周。

1.6 胸主动脉病理组织学检测 分离胸主动脉，取2～3 cm，置于10%中性福尔马林缓冲液。酒精脱水，中性树胶封片，常规石蜡切片，HE染色，光镜观察血管内皮细胞的损伤程度。

1.7 空腹血糖（FBG）测定 药物治疗前后，用美国强生血糖仪测定大鼠尾静脉血糖。

1.8 胸主动脉p22phox mRNA、p47phox mRNA表达检测 取大鼠胸主动脉，提取总RNA后进行逆转录反应，qRNA扩增，以GAPDH作为内参。p22phox引物上游：5'-TTGTTGCAGGA GTGCTCATC-3'， 下 游 ： 5'-TGGGCCATTTCTGTGTGTAA-3'，产物片段 282 bp；p47phox引物上游：5'-CCCAGCGACA GATTAGAAGC-3'， 下 游 ： 5'-TGACTGCCTCCTCTCATCCT-3'，产物片段475 bp；GAPDH引物上游：5'-CAAGGTCATCCATG ACAACTTTG-3'，下游：5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，产物片段496 bp。采用自动电泳凝胶成像分析仪分析。

1.9 统计学方法 采用SPSS17.0软件处理，正态分布计量资料以(±s)表示，非正态分布的数据通过对数变换使其接近正态分布；多个均数间比较采用方差分析，两样本比较采用t检验；计数资料用χ2检验。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 造模过程中，总共有9只大鼠没有达到高血糖标准；模型组死亡1只，发现腹部有撕咬伤口，考虑打斗致死；DJC低剂量组死亡1只，发现尾部破溃糜烂，考虑继发感染致死；DJC高剂量组死亡1只，未发现特殊异常，死因无法判断。最后结束时，空白对照组、模型组、DJC低剂量组、DJC中剂量组、DJC高剂量组的数量分别为：9、8、9、10、9只。

2.2 糖尿病动脉硬化大鼠模型的评价 见图1，图2。HE染色切片显示，空白对照组(A)大鼠主动脉内膜光滑，无局部缺损；内皮细胞完整；中膜层平滑肌细胞排列整齐，无增生现象。造模组(B)大鼠主动脉内膜有明显损伤，连续性被破坏；内皮细胞部分脱落，细胞体积和细胞间的连接间隙增大；中膜平滑肌排列紊乱，内皮细胞受损明显，说明造模成功。

图1 空白对照组大鼠胸主动脉组织H E染色切片结果(×400)

图2 造模组大鼠胸主动脉组织H E染色切片结果 (×400)

2.3 各组大鼠治疗前后FBG水平比较 见表1。与空白对照组比较，模型组大鼠治疗前后FBG水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与治疗前比较，DJC中、高剂量组大鼠FBG降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，治疗后DJC中、高剂量组大鼠FBG水平降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。与DJC低剂量组比较，治疗后DJC中、高剂量组大鼠FBG水平较低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠治疗前后FBG水平比较(±s) mmol/L

表1 各组大鼠治疗前后FBG水平比较(±s) mmol/L

与空白对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与DJC低剂量组比较，③P＜0.05；与治疗前比较，④P＜0.01

组 别空白对照组模型组D J C低剂量组D J C中剂量组D J C高剂量组n 989109治疗前4.89±0.7821.01± 3.12①21.00±3.0420.82±3.1120.76±3.24治疗后4.49±0.5220.23± 2.45①19.71±2.8114.57± 3.34②③④14.73± 3.00②③④

2.4 各组大鼠p22phox mRNA、p47phox mRNA表达比较 见表2，图3。与空白对照组比较，模型组大鼠胸主动脉p22phox mRNA、p47phox mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，DJC低、中、高剂量组大鼠胸主动脉p22phox mRNA、p47phox mRNA表达降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。与DJC低剂量组比较，DJC中、高剂量组大鼠胸主动脉p22phox mRNA、p47phox mRNA表达较低，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表2 各组大鼠p22phox mRNA、p47phox mRNA表达比较(±s)

表2 各组大鼠p22phox mRNA、p47phox mRNA表达比较(±s)

与空白对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与DJC低剂量组比较，③P＜0.01

组 别空白对照组模型组D J C低剂量组D J C中剂量组D J C高剂量组n 989109 p22phox mRNA 0.50±0.021.09± 0.04①0.84± 0.01②0.70± 0.03②③0.65± 0.02②③p47phox mRNA 0.49±0.021.09±0.02①0.89±0.04②0.71± 0.02②③0.67± 0.04②③

图3 各组大鼠p22phox mRNA、p47phox mRNA表达结果

3 讨论

血管内皮功能损伤是糖尿病血管并发症的发病基础，也是2型糖尿病(T2DM)大血管病变一个重要的初始步骤[9]。糖尿病患者长期的高糖状态及持续的血糖波动，导致体内抗氧化活性物质减少，氧化应激引起血管内皮炎症，损伤血管内皮功能[10]。有研究结果显示，高糖状态通过上调促血管生成素2(Ang-2)表达，下调血管内皮生长因子(VEGF)表达，抑制血管内皮细胞形成血管样结构的能力[11]。血浆内皮素-1(ET-1)、NO是反映内皮功能的重要指标，NO是血管舒张因子，ET-1可收缩各种血管，两种因子的相互协调维护正常的血管张力，若此种平衡被打破，导致内皮依赖性血管舒张功能受损，促成或加重血管病变[12]。

氧化应激是机体在受到内外环境有害因素刺激后，体内的活性氧簇被诱发生成，起初机体自身调节机制可以将其清除，但随着生成的日益增多，过剩的那部分便会对机体造成巨大的损害。血管组织中的氧化应激可以造成血管内皮功能损伤，导致内皮依赖性舒张功能损伤[13]。高糖诱导细胞凋亡的主要因素是氧化应激。在高糖环境下，活性氧(ROS)形成增多，通过激活多元醇、蛋白激酶C(PKC)、JNK、PI3K/AKT等信号通路诱发内皮细胞造成内皮功能障碍[14]。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)是反映机体抗氧化能力的常用指标，糖尿病合并血管并发症患者SOD和GSH-px水平会出现不同程度的降低[15]。NADPH氧化酶是一种过氧化物酶，是体内ROS的重要来源之一。p22phox、p47phox是NADPH的两个重要亚基，p22phox、p47phox mRNA的表达水平与体内氧化应激的强弱有密切的关系。

方朝晖教授针对T2DM大血管病变做了诸多的理论文献研究，在总结前人经验的基础上，并结合多年的临床实践积累，认为2型糖尿病大血管病中医病机多为“气虚阴亏血瘀”，治疗当以益气养阴活血为大法，据此创制出丹蛭降糖胶囊。丹蛭降糖胶囊以牡丹皮、水蛭行气活血，化瘀通络；太子参补益脾肾之气；生地黄滋养脾肾之阴，菟丝子补肾固精；泽泻清热泻痰浊。全方阴阳互济，补通兼施，寒温并调，补不碍邪，攻不伤正，共奏益气养阴、活血通络之功。

本研究结果显示，丹蛭降糖胶囊干预12周后，能够降低糖尿病大鼠血糖，降低胸主动脉p22phox mRNA和p47phox mRNA的表达，抑制氧化应激，提示丹蛭降糖胶囊在防治糖尿病大血管并发症上具有广大前景，值得临床推广应用。