应用于胶体金免疫层析的MDMA单克隆抗体的制备与鉴定①

伍丽贤 陈 立 康可人

(广州万孚生物技术股份有限公司,广州 510663)

3，4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(3，4-methylene dioxymetham-phetamine，MDMA)是一种化学合成的具有兴奋和致幻作用的甲基苯丙胺类化合物，是摇头丸的主要成分[1]。MDMA是1912年由德国Merck公司研发的食欲抑制药物，后来因其具有精神致幻和欣快的作用在20世纪90年代成为世界最流行的滥用药物之一[2]。MDMA滥用后容易上瘾且依赖性强不易脱毒，导致各种暴力犯罪，对社会造成极大的危害[3]。因此及时有效快速的诊断是防止MDMA滥用的有效措施之一。目前对MDMA滥用的常用检测方法有化学试剂检测法、气相色谱法、高效液相色谱法和免疫检测法，其中胶体金免疫层析法是现今毒品现场快速检测最主要的方法[3]，它是利用抗原抗体免疫反应结合膜层析技术的一种新型现场快速检验技术，具有快速、准确、简便、成本低廉的特点，是国际公认的现场检测的首选方法[4,5]。根据美国食品和药品管理局的规定，MDMA快速检测试剂检测灵敏度为500 ng/ml，因此筛选出高特异性、合适灵敏度的MDMA单克隆抗体是制备MDMA快速诊断试剂的关键。本文通过特殊修饰的MDMA免疫原，有效筛选到特异灵敏的阳性细胞株，其抗体成功应用于胶体金免疫层析试剂中，为制备检测MDMA的胶体金免疫层析法提供了材料。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂及动物 RPM1640、胎牛血清(FBS)、HAT、HT、青链霉素溶液和聚乙二醇(PEG，Mv4000)均购自美国Gibco 公司；弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)购自美国Sigma 公司；小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0)为本实验室传代保存；羊抗鼠IgG-HRP 二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；MDMA 检测试剂盒(胶体金法)购自艾康生物技术(杭州)有限公司；小鼠单抗Ig 类/亚类鉴定用酶标二抗套装由洛阳佰奥通实验材料中心提供；硝酸纤维素膜为美国Millipore 公司产品；氯金酸购自天津化工厂；柠檬酸三钠购自广州试剂厂； MDMA-OVA和MDMA-KLH 偶联蛋白由本室制备保存；6～8周龄SPF级雌性BALB/c纯系小鼠由中山大学实验动物中心提供；实验室用水为超纯水，所用化学试剂均为分析纯级别。

1.1.2仪器 BB15 型CO2培养箱、Multiskan MK3酶标仪和NanoDrop 2000C 分光光度计均为美国Thermo Fisher 公司产品；倒置显微镜为重庆奥特光学仪器有限公司产品；ECFG21 高效细胞电融合仪为日本NEPA GENE 产品；Milli-Q AdvantageA10 超纯水仪为美国Millipore 公司产品；高速冷冻离心机为日本HITACH 产品；接触式喷膜机为美国Imagene Technology Inc 公司产品。

1.1.3标准品及尿液样本 MDMA 阳性标准品由广州正孚检测技术有限公司刘晓云博士惠赠。参照美国国家药物滥用研究所(NIDA)标准制备250、500、750 ng/ml的高中低3个灵敏度浓度。

阴性标准品取自健康人阴性尿样，加入浓度0.5% 叠氮钠防腐剂。编号为No.1、No.2、No.3，由本实验室配制。300例临床样本来自广州白云戒毒所、广东省第二人民医院。30种常见滥用药物及常用药物进行特异性检测系列由本实验室配制保存。

1.2方法

1.2.1动物免疫及细胞融合 首次免疫时用MDMA-KLH免疫原与等体积的FCA充分乳化后以100 μg/只的剂量于小鼠背部及腹股沟分多点皮下注射免疫BALB/c纯系小鼠，以后每14 d用MDMA-KLH免疫原与等体积的FIA乳化后加强免疫小鼠，用间接竞争ELISA方法[6]检测第3次免疫后7 d采集小鼠尾静脉血的血清效价，间接竞争ELISA方法如下：①包被：MDMA-OVA抗原以1 μg/ml包被酶标板，37℃孵育1 h或4℃放置过夜，洗板1次。②封闭：每孔加入200 μl含3%BSA的PBST 37℃孵育2 h后洗板1次。③加一抗：每孔加入50 μl 4 μg/ml 浓度的MDMA标准品然后加入50 μl的免疫血清37℃孵育反应30 min，洗板3次，并同时设对照孔(只加100 μl免疫血清)，且阴性对照孔加入100 μl 未经免疫的小鼠血清。④加二抗：每孔加入100 μl 20 000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP 37℃孵育反应30 min，洗板3次。⑤显色：每孔加入100 μl TMB显色液显色15 min。⑥终止：每孔加入50 μl 2 mol/L H2SO4，酶标仪450 nm读取吸光值。根据公式计算其抑制率[7]：(Y-X)/(Y-Z)×100%。其中X表示加入MDMA标准品及免疫血清的OD值，Y表示不加标准品的对照孔OD值，Z表示阴性对照孔OD值。抑制率越高代表血清中抗体对MDMA的敏感性越好，因此选择效价最高且抑制率最高的小鼠进行腹腔注射，免疫原剂量为100 μg/只。3 d后取其脾细胞与SP2/0按ECFG21电融合仪说明书步骤进行电融合，并将杂交瘤细胞滴加至40个96孔板中，放于5%CO2培养箱中37℃培养。

1.2.2间接竞争ELISA法筛选阳性细胞株 细胞融合后10 d左右待杂交瘤细胞长满孔底40%～50%时，以MDMA-OVA(1 μg/ml)包被酶标板，用间接竞争ELISA方法(同1.2.1中间接竞争ELISA方法)检测各孔细胞上清，筛选效价高且抑制率高的阳性细胞株转入24孔板中培养。采用有限稀释法[7]对阳性杂交瘤细胞株多次亚克隆直至筛选出阳性的单克隆细胞株，并对该细胞株进行扩大培养和冻存保种。

1.2.3腹水的制备及纯化 采用常规小鼠体内诱生法制备腹水[7]，并经过正辛酸-饱和硫酸铵法纯化得到单克隆抗体[8]。

1.2.4MDMA单抗抗体的鉴定

1.2.4.1效价的测定 采用间接竞争ELISA方法(同1.2.1中间接竞争ELISA方法)检测腹水及单克隆抗体的效价，包被MDMA-OVA(1 μg/ml)，以从1∶10 000稀释比开始以10倍梯度稀释腹水和抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为二抗，同时设阴性(N)、空白和阳性(P)对照，效价以P/N>2.1为阳性标准。

1.2.4.2单抗抗体特性鉴定 抗体亚类鉴定采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标抗体套装试剂盒鉴定，按试剂说明书操作。单抗抗体的SDS-PAGE电泳纯度鉴定参考文献[9]进行操作，上样量为2 μg。

1.2.5MDMA单抗抗体在胶体金免疫层析试纸的应用

1.2.5.1免疫胶体金溶胶的制备 取0.01%氯金酸水溶液100 ml加热煮沸，搅动下加入1%枸橼酸三钠水溶液，金黄的氯金酸水溶液在2 min内变为紫红色，继续煮沸15 min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积。取1 ml胶体金溶胶于离心管中，用0.1 mol/L K2CO3调节金溶胶pH值至9.0，加入20 μg MDMA单克隆抗体，混匀后室温放置2～3 min。加入50 μl 1%PEG20000溶液以饱和游离的胶体金。10 000 r/min离心30 min除去上清并用PB洗涤 2～3 次后，用含1% BSA的PBS配制成原体积的1/10放4℃保存[10]。

1.2.5.2胶体金免疫层析试剂的制备 将制备的免疫金溶胶按25 cm2/ml均匀涂布玻璃纤维制备金标垫。将MDMA-BSA偶联物(T线)和羊抗鼠二抗(C线)包被在硝酸纤维素膜上制备包被膜，放于25℃湿度<30%的干燥房干燥24 h。将包被膜、金标垫、样品垫和吸水纸如图1所示组装裁切成4 mm宽的试纸条。

1.2.5.3胶体金免疫层析试纸的临床应用 MDMA的胶体金免疫层析试剂是采用免疫竞争抑制法，即尿液中的MDMA小分子与包被在膜上的MDMA-BSA蛋白同时竞争胶体金标记的抗体。当尿液中MDMA浓度≥500 ng/ml时，T线不显色，呈阳性，当尿液中MDMA浓度<500 ng/ml时，T线显色呈阴性。①灵敏度检测：根据NIDA标准，MDMA检测灵敏度为500 ng/ml，用阴性尿液基质配制其±50% cut-off值标准品，即用试纸条检测250 ng/ml和750 ng/ml的标准品。②特异性检测：30种常见滥用药物及常用药物进行特异性检测用阴性尿液基质配制成100 μg/ml，检测MDMA试剂条与常用药物交叉情况。

2 结果

2.1MDMA单克隆抗体的制备和鉴定

2.1.1抗体纯度的鉴定 经过2次细胞融合，采用间接竞争ELISA法进行筛选，筛选得到4C10、4D10、7D11、8D4 4株分泌抗MDMA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对细胞株进行亚克隆后保存。

图1 胶体金免疫层析试纸条组装示意图Fig.1 Schematic diagram of colloidal gold immunochromatograohic strip

其中细胞株8D4能稳定分泌抗MDMA的抗体，体内诱生法制备单克隆抗体腹水，用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化，得到抗MDMA单克隆抗体。用SDS-PAGE电泳MDMA单抗分析得出该抗体分别有重链和轻链两条带，纯度约为93%(图2)。

2.1.2抗体效价的测定 采用间接ELISA法测定8D4抗体的效价为1∶1×106左右，检测结果如图3所示。

2.1.3单抗抗体类型及亚类鉴定 使用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶(HRP)标抗体套装鉴定MDMA 8D4单抗Ig亚类为IgG1型，见图4。

图2 抗体的SDS电泳图Fig.2 SDS-PAGE for purified MabsNote:Lane 1.8D4；Lane 2.Marker.

图3 抗体效价测定结果Fig.3 Titer of purified Mabs

图4 抗体亚类鉴定Fig.4 Identification of antibody subclasses

2.3.1MDMA单抗在胶体金免疫检测中的应用 将制备的免疫金溶胶按25 cm2/ml均匀涂布玻璃纤维制备金标垫，与包被好MDMA抗原的NC膜组装成检测试剂条，分别检测阴性尿液样本、阳性标准品和30种常用药物。

2.3.1.1胶体金检测阴性和阳性尿样结果 用组装好的MDMA胶体金试剂盒检测编号为No.1、No.2、No.3阴性尿液，以及250、500、750 ng/ml的3个浓度阳性标准品。根据NIDA标准，要求MDMA免疫层析检测试剂阳性检测限为500 ng/ml，因此检测阴性和阳性250 ng/ml时T线显色，结果呈阴性；检测阳性500 ng/ml和750 ng/ml时T线不显色，结果呈阳性。检测结果如图5和图6。

2.3.1.2药物交叉反应检测 取30种常见滥用药物及常用药物进行特异性检测，结果如表1显示。MDMA检测试剂盒仅与盐酸麻黄碱、盐酸摇头丸、甲基苯丙胺、盐酸安非他命、安非他命、盐酸伪麻黄碱6种苯丙胺类药物有交叉反应；与其他毒品和药品没有非特异性反应，显色为阴性结果。摇头丸的主要成分是MDMA，故显色为阳性，其他5种药物是苯丙胺类药物及其衍生物，其结构类似，所以有交叉反应为正常现象。结果显示该抗体特异性良好。

2.3.1.3临床尿样的检测 用组装好的MDMA试剂盒检测300份临床尿样，其中有280份为非吸毒人员阴性样本，20份确诊为MDMA阳性样本。检测结果如表2显示MDMA试剂盒能检测出全部阳性样本，阳性符合率为100%，MDMA试剂盒能检测出全部阴性样本，阴性符合率为100%。

图5 阴性测试结果Fig.5 Test results of negative samples

图6 阳性测试结果Fig.6 Test results of positive samples

表1常见滥用药品及常用药品交叉反应检测结果

Tab.1Determinationofcross-reactionformostusedandabuseddrugs

DrugsColor⁃renderingindexDrugsColor⁃renderingindexDrugsColor⁃renderingindexEphedrineHydrochloride++Caffeine+++PseudoephedrineHydrochloride++PethidineHydrochloride+++CocaineHydrochloride+++TabellaeParacetamoli+++MethylmorphinePhosphate+++TramadolHydrochloride+++Paracetamol+++Acetylcodeine+++Amitriptyline+++DextromethorphanHydrobromide+++FentanyiCitrate+++Methamphetamine+CefaclorCapsules+++Methadone+++Epobarbital+++Estroven(Sleepingpill)+++Ketamine+++Morphine+++Extenze(Aphrodisiac)+++Oxycodone&Acetaminophen+++O3AcetylMorphine+++Cephalexin+++HydrochloricEcstasypill-AmphetamineHydrochloride++LidocaineHydrochloride+++Oxazepam+++Amphetamine++Levonorgestrel+++

Note：Concentration of these drugs were 10 μg/ml，“+++” was the most deepest color with strongly positive result of T line，“++” was the second deep color with negative result of T line，“+” was the third deep color and it was positive result of T line，“-”was strongly positive result with no color of T line.

表2临床尿样检测结果

Tab.2Determinationofclinicalurine

TheconfirmedurinesamplesNegativePositiveTotalGoldcolloidalimmunochromatographictestkitofMDMANegative2800280Positive02020Total28020300

3 讨论

3.1免疫偶联载体蛋白的选择 选择正确的蛋白载体是制备小分子抗体的关键。本文采用KLH为载体成功合成了MDMA人工抗原并在胶体金产品上获得良好的效果。由于血蓝蛋白来源于无脊椎动物，与常用于免疫的哺乳动物(例如鼠、兔、羊等)同源性最远，因此最易产生抗体，但产生的大量抗体主要是针对血蓝蛋白本身，而针对偶联的半抗原的抗体只占很小一部分；相反，来自哺乳动物的白蛋白因为与用作免疫动物的同源性较高，因而最难产生抗体，产生的抗体多数针对偶联的半抗原。但根据文献报道[11,12]，用KLH偶联的完全抗原会比用BSA偶联的完全抗原免疫小鼠所产生的抗体血清的特异性更强，原因可能为：一是KLH分子量大，表面有更多的半抗原结合位点，免疫过程中能使抗原的特征基团暴露面更大从而获得特异性更强的抗体[13]；二是带BSA载体的完全抗原从乳化到注射免疫过程中会经历一次蛋白结构外翻再于小鼠体内复性的过程，复性后蛋白表面的半抗原分子可能被包裹到蛋白内部，而KLH则不存在这个过程，故其能产生特异性更强的抗体[14,15]。

3.2有效的ELISA检测系统的建立 建立有效的ELISA筛选机制同样是人工抗原应用到胶体金产品上的重要因素。毒品类胶体金检测系统具有快速反应的特点，它要求抗原抗体在室温下5 min之内完成反应，但ELISA检测系统抗原抗体反应通常需要在37℃反应半小时以上，因此本文在检测小鼠免疫血清及在筛选杂交瘤细胞时用间接竞争ELISA方法来筛选以选出效价高且对MDMA小分子敏感性高的抗体。