美沙拉嗪通过抑制经典炎性信号通路激活治疗噁唑酮诱导的小鼠结肠炎中炎症反应①

曾建梅 徐 辉

(西南医科大学临床医学院消化内科，泸州 646000)

炎症性肠病是一种病因未明的肠道炎症疾病，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn′s disease,CD)[1],UC的病理特征主要以结肠黏膜炎症和溃疡形成为主，患者常伴有腹痛腹泻、脓血便[2]。UC是一种慢性进行性疾病，目前对于UC的发病机制并不明确，可能原因有免疫失衡、环境和外界感染有关[3]。免疫失衡在UC进程及预后中的作用已得到公认[4]，细胞因子的大量释放进一步加剧了肠道炎症反应，已有研究证明经典炎症信号通路NF-κB在炎症性肠病中处于显著激活状态，同时此信号通路调控的下游炎症因子介质参与疾病的发生与发展[5]。噁唑酮是一种半抗原，可以诱导小鼠接触部位产生过敏性反应[6]，目前已证明噁唑酮诱导的结肠炎是由IL-4介导的Th2型免疫反应[7]，与临床UC症状相似，可作为理想的人类UC的动物模型，探究药物治疗作用与机制，本研究旨在揭示临床治疗溃疡性结肠炎一线药物美沙拉嗪在噁唑酮诱导的UC模型中作用机制。

本研究中我们首次致敏采用3%噁唑酮乙醇溶液涂抹小鼠皮肤，24 h后使用同样浓度的噁唑酮溶液涂抹小鼠皮肤进行二次致敏，5 d后采用硅胶管经肛门插入小鼠肠道，灌注1%的噁唑酮乙醇溶液诱导小鼠产生UC，选择经典炎症信号通路NF-κB及其临床UC治疗一线药物美沙拉嗪为研究对象。研究美沙拉嗪在治疗噁唑酮诱导的小鼠UC中的作用与机制。

1 材料与方法

1.1动物 于扬州大学比较医学中心购买60只7～8周龄的BALB/c雌性小鼠，体重26～28 g，按SPF动物饲养要求饲养，自购买之日起适应性喂养1周。

1.2方法

1.2.1造模 结束适应性饲养后小鼠随机分为对照组、模型组、美沙拉嗪低剂量给药组和高剂量给药组，每组15只小鼠。剂量给药组和所有小鼠在腹部去毛产生2 cm×2 cm大小区域，采用关丽华等[8]的实验操作方法，第一次致敏：在此无毛区对照组涂抹0.2 ml纯乙醇，模型组和给药组涂抹2 ml 3%的噁唑酮乙醇溶液；第二次致敏：在第一次致敏结束后24 h，所有组小鼠按第一次致敏剂量重复致敏操作；第二次致敏结束5 d后，所有小鼠禁食不禁水24 h，使用10%水合氯醛水溶液按3 μl/g体重腹腔注射麻醉小鼠，对照组小鼠按0.15 ml/g体重使用硅胶管经肠灌注50%乙醇水溶液，灌注结束后倒置小鼠30 s，同时给药组和模型组小鼠按相等剂量相同操作灌肠1%噁唑酮乙醇(50%)溶液。造模结束后给予小鼠正常饮食和自由饮水。

1.2.2治疗 本研究采用治疗给药方式，灌肠造模后分别给予低高剂量给药组小鼠灌胃100、200 mg/kg 体重的美沙拉嗪0.5%的羧甲基纤维素钠悬浊液，对照组和模型组分别按体重灌胃相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠。每天定时灌胃1次，记录小鼠体重变化，连续治疗7 d。

1.2.3体重变化情况 结束适应性喂养后，整理所有小鼠在造模治疗期间体重变化趋势。

1.2.4结肠病理学损伤程度评估 给药治疗结束后，所有小鼠摘眼球取血后处死。保留小鼠结肠部位做后续研究，切取同一部位结肠进行石蜡包埋和HE染色，在组织学水平综合评价结肠病理学损伤程度。

1.2.5小鼠机体炎症反应程度 ELISA法测定小鼠血清中炎症因子IL-4和IL-13水平，检测机体Th2型炎症反应程度。

1.2.6生理生化指标检测 取小鼠同一部位结肠组织，匀浆后取上清测定组织髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)。

1.2.7小鼠组织NF-κB通路关键蛋白表达情况 Western blot法检测NF-κB信号通路中关键调控蛋白的表达水平，研究NF-κB信号通路在噁唑酮诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中的作用。

2 结果

2.1每组小鼠体重变化比较 小鼠体重是一个直观表示小鼠机体生长发育水平的关键指标，能够准确反映小鼠生理和病理状态。模型组小鼠造模后体重明显下降，同时小鼠活动状态明显弱于正常对照组，差异明显，给药组小鼠总体体重有所恢复，表明美沙拉嗪在一定程度上有助于改善小鼠UC，结果见图1。

2.2小鼠结肠组织HE染色 在组织学水平进行石蜡包埋切片之后，HE染色检测小鼠结肠病变情况以及给药治疗后小鼠结肠组织病变恢复状态。从结肠形态结构图可知：模型组小鼠结肠组织基本结构损伤严重，隐窝消失，伴有明显的炎性细胞浸润。给药组能够有效地缓解结肠损伤，能够明显恢复小鼠肠道结构。结果见图2。

图1 每组小鼠体重变化趋势Fig.1 Trend of weight change in each group of mice

图2 小鼠结肠组织HE染色Fig.2 HE staining of colonic tissue in mice

GroupsDose(mg/kg)MPO(U/g) Controlgroup0 77±0 25 Modelgroup2 02±0 721) Lowdosegroup1001 54±0 442) Highdosegroup2001 37±0 622)

Note：Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.001.

表2美沙拉嗪对噁唑酮诱导的结肠炎小鼠血清Th2细胞因子水平的影响

Tab.2EffectofmesalazineonserumTh2cytokinesinoxazoloneinducedcolitismice

GroupsIL⁃4(ng/L)IL⁃13(ng/L) Controlgroup46 38±7 62 19 86±3 47 Modelgroup179 67±11 381)52 51±5 371) Lowdosegroup89 42±9 282)31 49±4 662) Highdosegroup93 41±9 652)34 33±5 192)

Note：Compared with control group,1)P<0.01;compared with model group,2)P<0.001.

图3 美沙拉嗪对小鼠结肠组织经典炎性信号通路关键蛋白的影响Fig.3 Effect of mesalazine on key proteins of classical inflammatory signaling pathway in colon tissue of miceNote:1.Control group;2.Model group;3.Low dose group;4.High dose group.

2.3美沙拉嗪对噁唑酮诱导的小鼠结肠炎结肠组织中MPO含量的影响 MPO作为中性粒细胞的产物，可用于评价中性粒细胞浸润水平。与对照组相比模型组结肠组织MPO显著增高(P<0.05)；与模型组相比，给药治疗后小鼠的结肠组织MPO含量显著下降(P<0.05)。结果见表1。

2.4美沙拉嗪对噁唑酮诱导的结肠炎小鼠血清Th2细胞因子水平的影响 噁唑酮诱导的小鼠UC病症接近于人UC，属于Th2型免疫反应。使用ELISA法检测小鼠血清中Th2型炎症因子的表达水平。与对照组相比，模型组小鼠血清中IL-4、IL-13水平显著升高(P<0.05),与模型组比较，给药治疗组小鼠血清中IL-4、IL-13表达显著下降(P<0.05)，说明美沙拉嗪能在一定程度上抑制Th2型细胞免疫反应。结果见表2。

2.5小鼠结肠组织中NF-κB通路中关键蛋白的变化 与对照组相比，模型组小鼠结肠组织中p-p65、p-IκB蛋白的表达显著增加，同时p65、IκB蛋白的降低，表明在噁唑酮诱导的UC中经典炎症信号通路处于激活状态；与模型组比较，各给药治疗组小鼠结肠组织p-p65、p-IκB蛋白下调，说明美沙拉嗪可以抑制NF-κB通路的激活，从而经经典炎症通路发挥抗炎作用。结果见图3。

3 讨论

UC作为炎症性肠病中的一大类，其病变主要位于结肠黏膜及黏膜下层，易出现黏膜水肿、糜烂和溃疡[2]。目前UC发病机制尚未明确，研究者认为其与环境、免疫、遗传等均具有密切关系[3]。免疫失衡在UC进程及预后中的作用已得到公认[4]，细胞因子的大量释放进一步加剧肠道炎症损伤。研究者常利用动物模型模拟人UC[9-11]，探究UC发病机制和药物干预治疗效果和治疗机制。噁唑酮作为一种半抗原，能够诱导小鼠产生过敏反应，最终导致小鼠出现UC症状[6]，此种模型类似于人UC，常被用于研究使用。经典炎症信号通路NF-κB与机体免疫和炎症密切相关，在其余小鼠结肠炎模型组已验证其处于显著激活状态[5]，这与我们构建的噁唑酮UC模型研究具有相似之处。同时已有报道称噁唑酮诱导的小鼠UC属Th2型免疫反应，我们研究发现Th2型细胞因子IL-4、IL-13在噁唑酮模型中处于上调状态，这与关丽华等[8]的研究一致，证明了噁唑酮模型的有效性和特异性。

本次研究中我们选取了临床上用于治疗UC的一线药物美沙拉嗪，通过建立有效的动物模型，并且给予不同剂量的药物治疗诱导型结肠炎，通过组织学和生理水平评价机体损伤和抗损伤机制，可以为临床常用药物治疗结肠炎提供系统有效的系统性实验资料[12，13]。本研究中采用不同剂量的噁唑酮乙醇溶液经2次皮肤致敏和一次肛门灌肠诱导小鼠产生实验性结肠炎模型，同时在治疗中灌胃给予市售药物美沙拉嗪，已有研究表明美沙拉嗪可以抑制引起炎症的前列腺素的合成和炎性介质白三烯的形成,从而对肠黏膜的炎症起显著抑制作用[14-16]，同时我们研究发现噁唑酮诱导的UC小鼠结肠组织中经典炎症信号通路处于显著激活状态，同时美沙拉嗪对该通路具有显著的抑制效果，这有助于治疗噁唑酮诱导产生的机体炎性反应，同时美沙拉嗪对于噁唑酮引起的机体免疫失衡具有很好的调节作用，能够显著下调血清中Th2型细胞因子水平，进一步说明美沙拉嗪可以通过促进免疫平衡治疗溃疡性结肠炎。