槲皮素对CVB3诱导的新生小鼠病毒性心肌炎氧化应激损伤和炎性反应的调节①

韦迎娜 韩圣娜

(海南省第三人民医院心内科，三亚 572000)

心肌炎是一种由病毒感染、物理及化学等因素导致的心脏炎症性病变，会造成致命性伤害，尤其是对年轻人。病毒感染是引发心肌炎最最要的原因，病毒感染会对心肌细胞造成直接损害，引发炎症反应从而增强心肌毒性和相关的发病率[1-3]。据统计约21%的心肌炎患者会发展成扩张性心肌病，心肌炎是引起扩张性心肌病和心脏猝死的常见原因[4-6]。开发心肌炎治疗方法对人类健康事业具有重要意义。目前发现了一些天然产物具有改善心肌炎的效果[7]。槲皮素(化学结构式见图1)属于黄酮醇类物质，是蔬菜、水果和茶的重要抗氧化剂，在洋葱、苹果及草莓中含量尤其丰富[8]。大量研究表明槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血糖等多种生物学活性[9]。流行病学研究表明，在膳食中摄入更多的槲皮素可降低心血管疾病的发病风险[10]。目前槲皮素已被广泛用作营养补充剂和植物化学药物，有利于癌症、糖尿病/肥胖及脑血管疾病的治疗[11-14]。槲皮素在心肌炎中的研究十分有限，尤其对病毒性心肌炎中的作用尚不清楚。本研究主要目的是探索槲皮素对病毒性心肌炎新生小鼠氧化应激损伤和炎症反应的调节作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂 75只BALB/c新生小鼠购自中国科学院实验动物中心。槲皮素购自美国Sigma公司。CVB3病毒由上海中山医院病毒性心脏病重点实验室惠赠。Accu-check活力血糖仪购自美国罗氏公司。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)检测试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司。ELISA试剂盒[IL-1β,IL-6,诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)]购自美国R&D公司。抗TGF-β1、抗p-NF-κB P65和抗TNF-α抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理 小鼠随机分为3组：未感染正常组(normal)；模型组(CVB3)；治疗组[CVB3+Quercetin(50 mg/kg)]，每组25只。模型组和治疗组腹腔注射0.1 ml 含1×10半数组织细胞感染量(TCID50)CVB3的病毒液,正常组腹腔注射等量不含病毒的培养液。同时治疗组灌胃给药槲皮素(50 mg/kg)，正常组和模型组予以等量蒸馏水灌胃。

图1 槲皮素化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of quercetin

1.2.2血糖浓度检测 CVB3感染3、6、9、12 d 时采集乳鼠尾部血液，用全血通过罗氏Accu-check活力血糖仪检测各组乳鼠血糖浓度。

1.2.3氧化应激指标检测 CVB3感染3、6、9、12 d 时，收集待测乳鼠血清，利用SOD、MDA和LDH试剂盒按照说明书对乳鼠血清SOD、MDA和LDH水平进行检测。

1.2.4ELISA检测炎症因子水平 CVB3感染3、6、9、12 d时，依照ELISA试剂盒说明书对乳鼠血清炎症因子水平进行检测，首先将样品加入反应孔，37℃孵育45 min，洗涤后加入生物素标记的抗-IgG抗体，37℃孵育30 min，然后加链霉亲和素-HRP 混匀，37℃反应30 min。最后加入显色剂避光显色15 min，加终止液终止反应，450 nm处检测吸光值。

1.2.5蛋白印迹 收集各组乳鼠待测心肌细胞，首先用PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液进行裂解提取总蛋白，100℃变性5 min。然后等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜。5%的BSA封闭1 h后加入相应的一抗，4℃过夜孵育。第2天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1槲皮素可提高CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠存活率 如图2所示，CVB3感染3 d后模型组乳鼠存活率急剧下降，明显低于正常组(P<0.05)。与模型组相比，治疗组乳鼠存活率升高(P<0.05)。CVB3感染5 d以后模型组乳鼠存活率稳定在40%以下，治疗组乳鼠存活率则维持在80%以上。上述结果表明，槲皮素可提高CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠存活率。

2.2槲皮素会降低CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠心脏重量/体重比值 图3显示，CVB3感染3 d后模型组乳鼠心脏重量/体重比值(Heart weight/body weight,HW/BW)明显高于正常组(P<0.05)。与模型组相比，治疗组乳鼠HW/BW比值降低，但无统计学意义。随着CVB3感染天数的增加，模型组乳鼠HW/BW比值也在上升，CVB3感染9 d后治疗组乳鼠HW/BW比值明显低于模型组(P<0.05)。由此可见，槲皮素可抑制CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠HW/BW比值的升高。

2.3槲皮素可降低CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠血糖浓度 由图4可知，CVB3感染3 d时模型组乳鼠血糖浓度达到峰值，之后缓慢降低，维持在8 mmol/L左右，明显高于正常组(P<0.05)。治疗组乳鼠血糖浓度也是在CVB3感染 3 d 时达到峰值，但明显低于模型组(P<0.05)。以上结果说明，槲皮素处理会降低CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠血糖浓度。

2.4槲皮素会减轻CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠氧化应激损伤 如图5所示，CVB3感染6 d和9 d时，模型组乳鼠SOD水平明显低于正常组，MDA和LDH水平明显高于对照组(P<0.05)。与模型组相比，CVB3感染6 d和9 d时治疗组乳鼠SOD水平明显升高，MDA和LDH水平明显下降(P<0.05)。上述结果表明，槲皮素可改善CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠氧化应激损伤。

图2 小鼠生存曲线Fig.2 Survival curve of miceNote:Compared with normal group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

图3 乳鼠心脏重量/体重比值(HW/BW)Fig.3 Rate of heart weight/body weight(HW/BW)of neonatal ratNote:Compared with normal group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

2.5槲皮素可减弱CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠炎症反应 图6显示，模型组乳鼠IL-1β和IL-6水平在CVB3感染6 d时急剧升高，且明显高于正常组(P<0.05)。治疗组乳鼠IL-1β和IL-6水平在CVB3感染6 d时则明显低于模型组(P<0.05)。与正常组相比，模型组乳鼠iNOS水平在CVB3感染6 d和9 d时明显升高(P<0.05)。治疗组乳鼠iNOS水平在CVB3感染6 d和9 d时明显低于模型组(P<0.05)。由此可见，槲皮素会降低CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠炎症反应。

图4 血糖浓度Fig.4 Concentration of blood sugarNote:Compared with normal group,*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

图5 氧化指标检测Fig.5 Oxidative index detectionNote:Compared with normal group,*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

图6 ELISA检测炎症因子Fig.6 Levels of inflammatory factor were detected by ELISANote:Compared with normal group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

图7 蛋白印迹检测NF-κB通路相关蛋白表达Fig.7 Expression of NF-κB pathway related proteins was tested by Western blotNote:Compared with normal group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

2.6槲皮素会抑制NF-κB通路的激活 如图7所示，模型组乳鼠TGF-β1和p-NF-κB P65表达水平在CVB3感染6、9和12 d时明显高于正常组(P<0.05)。治疗组乳鼠TGF-β1和p-NF-κB P65表达水平在CVB3感染6、9和12 d时明显低于模型组(P<0.05)。与正常组相比，模型组乳鼠TNF-α表达水平在CVB3感染6 d和9 d时明显升高(P<0.05)。治疗组乳鼠在CVB3感染6 d和9 d时TNF-α表达水平明显低于模型组(P<0.05)。以上结果说明，槲皮素可通过抑制NF-κB通路的激活减轻CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠炎症反应。

3 讨论

目前针对心肌炎的治疗主要是辅助支持疗法，另外还有免疫疗法和抗病毒治疗，但这些方法治疗效果并不理想[15-17]。氧化应激和炎症反应是心肌炎的主要病征[2,3]。大量文献报道了许多天然产物在改善心肌损伤及减轻氧化应激和炎症反应方面具有积极的作用。

近年来植物提取物在疾病治疗方面受到了越来越多的关注。有研究表明豆蔻提取物可提高CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠3周存活率[18]。来源于尾叶香茶菜提取物的ORI2可提高CVB3诱导的病毒性心肌炎大鼠2周存活率[19]。据报道蜜花豆和掌叶大黄提取物均提高CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠30 d存活率[20,21]。有研究发现芹黄素可抑制自身免疫性心肌炎小鼠HW/BW比值的升高，改善心脏功能[22]。据报道黄连素具有降低自身免疫性心肌炎大鼠HW/BW比值的功能[23]。有数据显示槲皮素具有降低糖尿病大鼠及食源性肥胖小鼠血糖水平的功效[24,25]。本研究结果显示，在CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠中，槲皮素可提高新生小鼠存活率，抑制HW/BW比值的升高，降低血糖浓度。

氧化应激在心肌炎进程中十分重要，降低氧化应激有利于心肌炎的治疗[26]。有研究发现长蒴黄麻叶提取物可抑制砒霜诱导的心肌炎大鼠SOD活性降低及MDA水平的升高，改善氧化应激损伤[27]。据报道槲皮素可抑制H2O2诱导的大鼠心肌细胞H9C2中LDH的释放[28]。有研究表明槲皮素可抑制蛛网膜下腔出血诱导的大鼠大脑皮层MDA水平的升高[29]。Das等[30]发现槲皮素可提高短期高脂饮食小鼠SOD活性，降低MDA水平。本文结果表明，槲皮素可提高CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠SOD活性，降低MDA和LDH水平，减轻氧化应激损伤。

炎症反应是心肌炎主要病症之一，各种炎症因子在心肌炎中起着重要作用[31]。许多植物提取物都具有抗炎的功效。在CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠中，三七总皂苷可抑制血清促炎因子IL-6 和TNF-α释放[32]。据报道红景天苷可降低脂多糖诱导的败血症性心肌炎大鼠IL-1β和IL-6的分泌[33]。Mito等[34]研究表明在自身免疫性心肌炎大鼠中，姜黄素可降低iNOS的表达，减轻炎症反应。在高脂饮食诱导的肥胖症小鼠中，槲皮素处理会减弱IL-1β和IL-6的分泌[35]。在镍诱导的肝损伤小鼠中，槲皮素可降低IL-1β和iNOS水平[36]。有研究发现槲皮素可抑制四氯化碳诱导的肝损伤小鼠IL-1β和iNOS水平的升高[37]。本研究结果显示，槲皮素可降低CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠IL-1β、IL-6和iNOS水平，抑制炎症反应。

NF-κB信号通路在各类疾病中起着重要的调控作用[38,39]。Zempo等[40]发现来源于可可豆提取物的多酚物质可降低自身免疫性心肌炎小鼠p-NF-κB P65蛋白水平，抑制NF-κB 炎症通路的活化。在CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠中，姜黄素可抑制NF-κB P65激活[41]。大量研究表明槲皮素可通过NF-κB介导的炎症通路发挥抗炎作用[42]。Messer等[43]发现槲皮素可降低乳鼠成骨细胞NF-κB P65磷酸化水平。据报道在佐剂性关节炎大鼠中，槲皮素可抑制NF-κB P65活化[44]。本文结果显示，槲皮素可降低CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠TGF-β1、p-NF-κB P65和TNF-α蛋白水平，抑制NF-κB 通路激活。

本研究表明，在CVB3诱导的病毒性心肌炎新生小鼠中，槲皮素可提高新生小鼠存活率，抑制HW/BW比值和血糖浓度的升高，增强SOD活性，降低MDA和LDH水平，抑制IL-1β、IL-6和iNOS分泌，减弱TGF-β1、p-NF-κB P65和TNF-α表达。综上所述，槲皮素可减轻CVB3诱导的新生小鼠病毒性心肌炎氧化应激损伤和炎症反应。下一步计划研究槲皮素对病毒性心肌炎新生小鼠心脏功能的影响，为心肌炎治疗提供新的方向。